供者未成熟樹突狀細胞聯合西羅莫司誘導大鼠皮膚移植物免疫耐受研究

[摘要]目的：觀察大鼠骨髓來源的未成熟樹突狀細胞(imDCs)聯合西羅莫司(SRL)在誘導大鼠同種異體皮膚移植免疫耐受中的協同作用。方法：以雄性Lewis大鼠為供者、Brown-Norway大鼠為受者，建立大鼠同種異體皮膚移植模型。對照（control）組術前不給予任何干預；未成熟樹突狀細胞(imDCs)組于術前7天經尾靜脈注射供者骨髓來源的未成熟樹突狀細胞；西羅莫司(SRL)組于術后連續7天經胃管灌注西羅莫司；聯合(imDCs+SRL)組于術前7天經尾靜脈注射供者骨髓來源的未成熟樹突狀細胞，并于術后連續7天經胃管灌注西羅莫司。結果：對照組、未成熟樹突狀細胞(imDC)組、西羅莫司(SRL)組、聯合(imDCs+SRL)組大鼠同種異體皮膚移植物術后存活時間分別為(8.25±1.75)、(10.25±1.91)、(10.64±2.50)、(21.38±2.97)天。方差分析提示組間差異有統計學意義(P＜0.05)；S-N-K檢驗提示除單獨應用未成熟DC組與單獨應用SRL組外，各組間的差異均有統計學意義(P<0.05)。結論：供者骨髓來源未成熟樹突狀細胞可誘導大鼠同種異體皮膚移植免疫耐受；聯合使用西羅莫司可延長移植皮片成活時間。

[關鍵詞]西羅莫司；未成熟樹突狀細胞；皮膚移植；大鼠

[中圖分類號]R622Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）02-0232-03

Induced immune tolerance to rat skin allograft by dornor immature dendritic cells and sirolimus

ZHANG Zi-xi，YANG Yang，XIA Wei，GUO Shu-zhong

(Institute of Plastic Surgery，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of donor immature dendritic cells (imDCs) and sirolimus (SRL) on the induced immune tolerance to rat skin allograft.MethodsThe recipient Brown-Norway rat receiving transplantation of skin allograft from Lewis rat were divided into control group(without perioperative treatments)，immature DC group (receiving injection of donor immature DC via tail vein 7d before skin transplantation)，sirolimus (SRL) group (receiving injection of sirolimus for 7 consecutive days after transplantation)，sirolimus (SRL) combined immature DC group (receiving injection of donor immature DC 7d before transplantation and sirolimus for 7 consecutive days after transplantation).ResultsThe survival time of the skin allograft in the control，immature DC，sirolimus (SRL) combined immature DC group groups were (8.25±1.75)、(10.25±1.91)、(10.64±2.50)、(21.38±2.97) d， respectively， showing significant diferences among the groups (P＜0.05)，and SNK test also indicated significant differences between each two groups． ConclusionsSirolimus (SRL) and donor immature DC have synergic effects in inducing skin allograft tolerance and prolonging survival time of skin allograft in rat．

Key words:sirolimus; dendritic cells; immune tolerance; rat; skin transplantation

樹突狀細胞(Dendritic Cells，DC)是一種專職的抗原提呈細胞，其最顯著的特點是可以激活初始T細胞，是適應性免疫應答的啟動者[1]。而未成熟樹突狀細胞(Immature D endritic Cells，imDCs)由于不能活化T細胞而導致T細胞的低反應性，所以成為移植免疫耐受的研究熱點[2]。未成熟樹突狀細胞作為免疫耐受的誘導劑，可成功誘導免疫低反應狀態[3]。西羅莫司(Sirolimus，SRL)為大環內酯類抗生素，同時也是一種新型免疫抑制劑，在預防和治療器官移植后的排斥反應中有顯著作用[4]。移植術后大劑量使用免疫抑制劑的毒副作用移植成為焦點，如何使用低毒無害的免疫抑制方案一直是目前研究的重點，聯合給藥或其他給藥途徑被證明可以明顯減少毒副作用[5-6]。以往研究認為SRL主要通過作用于T淋巴細胞而發揮免疫抑制作用，但近期研究表明SRL可作用于DC分化發育的不同環節，調節DC生物學功能[7-8]。為了進一步研究SRL是否可協同未成熟DC誘導受者免疫耐受，在本研究中我們使用供者未成熟DC對皮膚移植受者進行預處理，于術后聯合使用SRL，觀察移植皮片存活時間， 探討未成熟DC聯合SRL在誘導同種異體皮膚移植免疫耐受中的效果。

1材料和方法

1.1 實驗動物及試劑：本實驗使用Brown-Norway大鼠(BN，RT1n)和Lewis大鼠(LEW，RT11)，均為雄性，8～10周齡，150～220g；其中Brown Norway鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，Lewis大鼠由第四軍醫大學實驗動物中心提供，。西羅莫司口服液購自Wyeth公司。重組鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)及重組鼠白細胞介素4(rmlL-4)購自Peprotech公司。RPMI 1640培養基及胎牛血清為Hyclone公司產品。

1.2 未成熟DC的制備： 無菌操作下收集BN大鼠股骨的骨髓細胞，用Tris-NH4C1緩沖液溶解紅細胞，RPMI 1640洗滌2次后重懸細胞，調整細胞濃度為1×106/ml，再置于6孔培養板內，每孔2ml。在37℃體積分數為5%的CO2、95%濕度環境下培養3h。吸棄上清液，再用37℃預溫的RPMI 1640輕輕洗去非貼壁細胞，每孔加人RPMI 1640(含胎牛血清100ml/L、rmGM-CSF 10μg/L、rmIL 42μg/L、Hepes10mol/L、青霉素1000 U/ml、鏈霉素1000 U/m1)培養基2ml，繼續培養。每隔一天半量換液。7天后，反復吹吸收集疏松粘附細胞及懸浮細胞，即為未成熟DC。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態予以鑒定。

1.3 大鼠異體皮膚移植模型：以BN大鼠為供體，LEW 大鼠為受體。供體腹腔內注射50mg／kg戊巴比妥鈉麻醉，于其軀干背部以剪去全層皮膚一塊，刮盡皮肌，修剪成中厚皮，制成直徑1cm的圓形皮片，修剪成中厚皮；受體同樣方法麻醉后，背部胸腹交界處剃毛，皮膚消毒，用眼科剪刀以鉗夾法剪去全層皮膚一塊，形成約1cm2的圓形創面，勿傷及皮肌。將供者皮膚貼于創面處，間斷縫合皮膚邊緣，打包包扎，注意移植皮片毛的方向與受者毛的方向相反。5天后打開包扎，觀察皮片的存活情況，皮片變黑壞死脫落或全部形成干痂為皮片死亡。移植術前對LEW大鼠肌肉注射青霉素鈉2萬U／kg；術后再注射1萬U／kg，2次／天，共3天。

1.4 實驗分組設計：隨機將32只LEW 受體大鼠分為4組(每組8只)，32只BN供體大鼠分為4組(每組8只，對應分配于3組受體移植大鼠)。①對照(control)組：術前不給予任何干預措施；②未成熟樹突狀細胞(imDCs)組：于術前7天經尾靜脈注射供者骨髓來源的imDCs 2×106個/只；③西羅莫司(SRL)組：于術后連續7天經胃管灌注SRL 3mg.kg-1.d-1；④聯合(imDCs+SRL)組：使用imDCs于術前7天經尾靜脈注射，術后連續7天經胃管灌注SRL，用法同imDCs組及SRL組。

1.5 移植皮片病理學觀察及排斥反應分級：于移植術后第7天分別取各組大鼠的移植皮片，用40g/L的多聚甲醛液固定，常規石蠟包埋組織，切片后HE染色，光鏡下觀察皮片病理變化。鏡下皮片的排斥反應分級參照文獻[9]的分級標準。

1.6 統計學方法：采用統計學軟件SPSS 13.0，以方差分析檢驗各組均數問的差異，如果差異有統計學意義，S-N-K檢驗進一步行多重比較。

2結果

2.1 未成熟DC形態學檢測：未成熟DC培養24h后，光鏡下可見貼壁的單核細胞均勻分布。3天后大量的細胞疏松的貼附于板壁上呈簇狀生長。5天后細胞集落增多，呈懸浮生長，細胞形態不規則，表面有星狀毛刺疏松粘附細胞即為未成熟DC。

2.2 移植皮片病理學觀察：各組移植術后第7天移植物排斥反應分級。①對照（control）組：鏡下觀察，移植皮片表皮層斷裂，腺體結構消失，大量炎性細胞浸潤，分級為Ⅳ級；②未成熟樹突狀細胞(imDCs)組和西羅莫司(SRL)組：移植皮片皮下組織有出血，腺體結構不完整，但炎癥細胞浸潤較對照組明顯減輕，分級為Ⅲ級；③聯合(imDCs+SRL)組：皮片各層結構及皮膚附屬器形態完整，少量炎性細胞浸潤，分級為Ⅱ級。聯合使用imDCs及SRL可降低移植物排斥反應等級。

2.3 各組移植皮片生存時間(見表1):各組間差異具有統計學意義。control組8天左右移植皮片完全壞死脫落，imDCs組以及SRL組情況相似，7天左右皮膚出現局部潰瘍，10天左右移植皮片完全壞死，而imDCs+SRL組在7天時皮片成活較好，在2周左右皮片出現潰瘍，在3周左右移植皮片才形成干痂、壞死脫落。對照組與imDCs組、SRL組和imDCs+SRL組的移植皮片生存時間存在顯著差異（P＜0.05）；imDCs組與SRL組的移植皮片生存時間無顯著差異（P=0.74）；imDCs+SRL組與imDCs組、SRL組的移植皮片生存時間存在顯著差異（P＜0.05）。以上數據說明未成熟DC聯合應用SRL可顯著延長移植皮片的存活時間。

3討論

皮膚移植后的免疫排斥反應是典型的細胞性排斥反應，成熟DC表面表達豐富的MHC分子和輔助刺激因子，能有效地遞呈抗原并激活T細胞發生免疫應答，而未成熟DC表面高表達MHC分子，低表達輔助刺激分子，缺乏啟動T細胞應答的功能。由于未成熟DC這一特點，在誘導免疫耐受、延長移植物存活時間中應用[10]。目前已有動物試驗證實，未成熟DC的輸注能在一定程度上延長移植物的存活時間，但單獨應用未成熟DC的效果尚不能令人滿意，主要由于未成熟DC由于表面缺乏協同刺激因子即T細胞活化的第二信號而引起T細胞特異性無應答，但在攝取抗原后，或受到某些炎性細胞因子(如TNF-a)或某些細菌成分(如LPS)的刺激后，細胞表型迅速發生變化，表達高水平的協同刺激分子CD40和CD86，進入成熟狀態，失去耐受原作用進而誘發免疫應答反應 [11-12]。因此，如何使DC穩定地保持不成熟狀態是誘導免疫耐受的關鍵，而有關SRL的研究為解決這個難題提供了新的思路。

SRL為第三代免疫抑制劑，具有較強的抗移植排斥作用，且副作用明顯低于環孢素A，目前國內外均已將SRL應用于臨床器官移植術后患者。SRL的作用機制是通過與細胞內受體FK506結合蛋白12(FKBP12)結合，抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶哺乳動物西羅莫司靶蛋白(mTOR)的功能，從而阻斷細胞因子受體的信號轉導過程，阻止淋巴細胞從G 期進入S期，即抑制淋巴細胞在細胞因子誘導下的克隆增殖[13]。另一項研究則發現，此類藥物可抑制DC表面IL-18Rα和β的表達，從而減少IL-12的自分泌；同時通過阻斷Jak2/Stat4信號途徑阻止IL-12對自身IL-12R的激活，明顯抑制Dc的功能[14]。另外此類藥物還可以增加反應性T細胞對CD8+否決細胞的易感性，促進后者引發的T細胞凋亡[15-16]。西羅莫司也在體外可部分改善創傷小鼠DC功能，并提高其誘導T淋巴細胞的應答能力[17]。所以，如果能將未成熟DC與SRL結合起來，將有可能成為一種相對簡便、經濟的誘導免疫耐受的方案。國外文獻報道，與環孢素A及FK506常規免疫抑制劑相比，SRL與抗CD45RB、抗CD154等單克隆抗體具有更好的協同作用，聯合應用時可明顯提高受者對移植物的接納率并易于誘導嵌合體形成[18-19]。但目前對于未成熟DC聯合SRL在誘導大鼠移植免疫耐受中的作用尚無報道。

本實驗我們選擇了大鼠皮膚移植模型，皮膚移植與心、腎等實質器官移植相比，具有排斥反應更強烈、誘導耐受更困難的特點。用供體未成熟DC預處理受者，1天后行異體皮膚移植術，在移植術后未應用任何免疫抑制措施的前提下，移植皮膚存活時間延長，說明供體未成熟DC可在體內誘導一定程度的免疫耐受。術后聯合使用SRL可使大鼠皮膚移植物的存活時間進一步延長，說明聯合使用SRL與未成熟DC在誘導大鼠皮膚移植免疫耐受中具有協同作用。我們認為，在應用供者未成熟DC作為耐受原誘導受者免疫耐受時，短期輔以SRL會使排斥反應降低，移植物存活時間延長。

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[收稿日期]2010-10-20 [修回日期]2010-01-07

編輯/張惠娟