I型IP3受體在自體中厚移植皮片中的表達

[摘要]目的：檢測I型1，4，5--三磷酸肌醇受體 (type I inositol 1，4，5-triphosphate receptor， IP3R1)在人自體中厚移植皮片中的表達，初步認識由IP3受體介導的鈣信號轉導在自體中厚移植皮片過度色素沉著發生機制中的作用。方法：利用免疫組化SP方法，檢測IP3R1在自體移植中厚皮片、受區周圍與供區正常皮膚中的表達并進行統計學分析。結果：IP3R1的表達定位于表皮基底部黑素細胞、角質形成細胞胞漿，在大部分自體中厚移植皮片中呈強陽性表達，與自體正常對照皮膚中的表達差異有顯著性意義(P<0.05)；IP3R1在受區周圍和供區正常對照皮膚中的表達差異無顯著性意義。結論：IP3R1在自體中厚移植皮片中的表達比自體正常對照皮膚中顯著提高，推測由IP3R1介導的胞內鈣庫鈣離子釋放參與了鈣信號轉導在自體移植皮片過度色素沉著中的調控作用。

[關鍵詞]IP3受體；鈣信號轉導；自體移植皮片；過度色素沉著

[中圖分類號]R622 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）02-0229-03

Expression ofIP3R1in human split-thickness skin autografts

DAI Hai-ying，XUE Chun-yu，XING Xin，MEI Xiang，ZHANG Pei-pei，LI Ming

(Department of Plastic Surgery，Changhai Hospital，The Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of IP3R1 in human split-thickness skin autografts and to recognize the role of calcium signal transduction in hyperpigmented process of the skin autografts.MethodsImmunohistoehemieal technique was adopted to detect the expression of IP3R1 in the split-thickness grafted skin，the normal skin around the recipient area and normal skin separately and statistics was used to analyze the data.ResultsThe expression ofIP3R1 was located in endochylema of melanocytes and keratinocytes in the basilar part of epidermis. The expression ofIP3R1 in most of the split-thickness grafted skin was significantly higher than the control skin， The positive integral optical density ofIP3R1 in the split-thickness skin grafts (0.47±0.07) was significantly higher than that in the normal skin around the recipient site (0.21±0.09) and in the normal skin around the donor site (0.19±0.08).Showing statistically significant difference (P<0.05)．The expression ofIP3R1 in the normal skin of the donor area was no statistic remarkably differences compared to the normal skin around the recipient area． Conclusion The results indicate that the expression ofIP3R1 may markedly increase in the split-thickness grafted skin and correlate with its pigmentation affer the skin autograft．Calcium signal transduction may play an important role in hyperpigmented process of the skin autograft．

Key words:IP3R;calcium signal transduction;skin autograft;hyperpigmentation

自體皮片移植是整形外科中常用的手術方法，在修復各種原因(燒傷、外傷、腫瘤切除術后、畸形矯正)引起的組織缺損、矯治外形及改善功能等方面發揮著重要作用。但自體皮片移植后常伴有不同程度的過度色素沉著，影響外觀，限制了其臨床使用范圍，目前對于引起這一現象的發生機制尚未完全闡明。有研究表明自體移植皮片中α-黑素細胞刺激素（α-melanocyte-stimulating hormone， α-MSH）的表達增加，激活其特異性黑皮素-1受體（melanocortin-1 receptor， MC-1R）而激發環磷酸腺苷/蛋白激酶A通路使黑素細胞合成、分泌黑素增多是自體移植皮片過度色素沉著的重要因素[1-2]；而α-MSH前體的合成、酪氨酸酶的激活等都需要鈣信號的參與[3]，本課題組前期研究亦發現在自體移植皮片中鈣調蛋白的表達量明顯增加。細胞內鈣信號的產生有細胞外Ca2+進入細胞質和胞內鈣庫Ca2+釋放兩種途徑，而自體移植皮片中鈣信號的產生主要通過何種途徑介導目前還不清楚。因此本課題擬應用免疫組織化學方法SP法檢測三磷酸肌醇受體(type I inositol 1，4，5-triphosphate receptor，typeI IP3R)在自體中厚移植皮片中的表達，進一步認識鈣信號轉導在自體移植皮片過度色素沉著中的作用機制。

1材料和方法

1.1 實驗標本：本實驗所用標本均取自面頸部自體移植中厚皮片術后1年左右，因局部皮片攣縮或皮片過度色素沉著等因素需再次手術的我科患者。年齡10～35歲，男10例，女6例，均無垂體腎上腺疾病、傳染病、皮膚病及免疫性疾病，局部無感染、潰瘍，術前未應用激素及免疫抑制劑治療，局部亦未曾行放射治療。將所取標本按取材部位分為三組，實驗組：受區移植皮片；對照組：受區周圍正常皮膚與供區周圍正常皮膚。標本切取后在30min內放入液氮瓶，12h內移人-80℃冰箱中保存。

1.2 主要試劑：I型IP3受體抗體（Santa Cruz 公司，美國）；SP免疫組化染色試劑盒，DAB 試劑盒（Sigma 公司，美國)等。

1.3 免疫組化步驟：皮膚標本經固定、脫水、石蠟包埋后。切成4mm石蠟切片，貼在涂有切片粘合劑的載玻片上。6O℃烤4～8h。將石蠟切片脫蠟至水，0.3%H2O2室溫20min，PBS洗3次，加入0.01mmol/L，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液，微波處理2次(每次10min)，修復抗原，冷卻后PBS洗2次。加I型IP3受體抗體1:100稀釋，4℃孵育過夜，徹底水洗，加入1:200生物素化兔抗鼠IgG，室溫30min，加1:400 StrepAvidin-HRP，室溫30min。以上各步驟均經0.01mmol/L PBS（pH7.4）沖洗3min，3次；然后將切片置0.05% DAB+0.03%H2O2顯色液中顯色8～12min；蒸餾水，沖洗，蘇木素復染1min；脫水，透明，中性樹膠封片。全部標本用PBS做空白對照。

1.4 觀察與結果判定：按照呂宏升[4]等提出的免疫組化定量分析圖像采集方法要求，設定好參數，所有切片的照相工作均一次完成，采用專業圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0測得切片上DAB顯色為棕黃色代表陽性區域的光密度值，每張切片分別隨機選取10個視野，測量光密度，取其平均值作為平均光密度值，并將以此代表實驗所研究蛋白的表達強度進行分析。

1.5 統計學處理：采用SPSS11.5 統計軟件包進行分析。實驗組與兩正常對照組的光密度值均以(x±s)表示。組間行配對t檢驗。

2結果

I型IP3受體主要位于黑素細胞、角質形成細胞胞漿，胞核亦有部分表達，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒或團塊，呈局灶性或彌漫性分布，蘇木素復染胞核呈藍色，背景清晰。在大部分自體中厚移植皮片中呈強陽性表達。在表皮基底層處形成棕褐色條帶（圖1)。I型IP3受體在自體移植中厚皮片實驗組中表達的平均光密度值為0.47±0.07。在受區周圍正常對照皮膚對照組中表達的平均光密度值為0.21±0.09。在原供區周圍正常皮膚對照組中表達的平均光密度值為0.19±0.08。I型IP3受體在實驗組中的表達與在兩對照組正常對照皮膚中的表達差異有統計學意義(P<0.05)，在兩對照組間的表達差異無統計學意義(圖2)。

3討論

自體皮片移植是整形外科中常用的手術方法，但因皮片移植后常伴有不同程度的過度色素沉著而限制了其臨床應用范圍，目前對于引起這一現象的發生機制尚未完全闡明。有研究表明自體皮片移植過程中，多種因素的作用致皮片中α-MSH的表達增加，繼而激活其特異性受體MC-1R，使黑素細胞內酪氨酸酶的表達增加、活性增強，促進黑素合成、分泌增加[5]，有研究亦表明α-MSH前體的合成[6]、酪氨酸酶的激活[7]等都需要鈣信號的參與。本課題組前期研究也發現在自體移植皮片中鈣調蛋白的表達明顯增加，表明鈣信號傳導的增強參與調控了皮片過度色素沉著過程。而細胞內鈣信號的產生有細胞外Ca2+進入細胞質和胞內鈣庫Ca2+釋放至細胞質兩種途徑[8]，而胞內鈣庫鈣離子釋放主要受IP3受體調控，故進一步了解皮片中IP3受體的表達情況有助于理解皮片中鈣信號增強產生的途徑和機制。

IP3受體廣泛分布于各組織細胞，至少有3種亞型：IP3R1，IP3R2和IP3R3，這3種亞型的氨基酸序列具有60%～70%的同源性，其中I型IP3受體分布于粗面內質網和外層核模[9-10]，釋放Ca2+能力最強[11]。IP3受體引起的Ca2+釋放具有以下幾個方面的特點：①雙相性：前期是快速釋放階段，隨之為慢速階段。前者的釋放速度與IP3的濃度成比例，而后者即使在恒定濃度的IP3下也非常緩慢；②雙激活劑：IP3受體通道的開放既受IP3的激活，也受Ca2+的激活。但Ca2+對通道開放的激活作用與Ca2+本身的濃度有關，在無IP3存在的情況下，低濃度(200～300 nmol/L)時通道激活，而高濃度抑制[12]；③負反饋：Taylor等[13]報道Ca2+與鈣調蛋白CaM結合可抑制IP3與受體結合，機制可能是CaM與IP3受體和Ca2+結合的部位相同，從而抑制IP3R通道的開放。IP3R通過以上幾種正反調控機制使胞內鈣的濃度處于動態平衡，維持細胞的正常生理狀態。

本組實驗研究通過免疫組化方法觀察到自體移植皮片中IP3受體表達量明顯增加，在前期研究中亦發現皮片中鈣調蛋白的表達量明顯增加，說明皮片中鈣信號表達的增加與胞內IP3受體激活后刺激內質網鈣庫釋放鈣離子有關，推測存在某種因素抑制Ca2+與CaM對IP3受體的負反饋作用或者是IP3受體調控胞庫內鈣釋放的閾值提高，使IP3受體表達增加，進而促進胞內鈣離子的釋放，導致鈣信號轉導增強，從而增加黑素細胞的黑色素合成與分泌，促進自體移植皮片的色素沉著。

自體移植皮片中黑素細胞合成、分泌黑色素的功能增強，有許多因素參與調控，過程較為復雜。本研究結果顯示自體移植皮片黑素細胞中IP3受體激活后刺激內質網鈣離子釋放，鈣信號發揮第二信使作用參與調控黑素細胞黑素合成、分泌過程，促進自體移植皮片色素沉著。有研究顯示內皮素、血管緊張素Ⅱ、血管加壓素和白三烯[14]等可刺激細胞內IP3水平增高促進細胞內Ca2+釋放，但在自體移植皮片過度色素沉著過程中，是何原因引起細胞內IP3受體表達增高，導致細胞內鈣信號轉導增強，在此過程中是否還存在細胞外鈣內流的增加目前都還不清楚，需進一步研究觀察。

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[收稿日期]2010-10-14 [修回日期]2010-01-13

編輯/張惠娟