6-O-羧甲基殼聚糖對人增生性瘢痕成纖維細胞TGF-β1表達的影響

[摘要]目的：觀察不同濃度6-O-羧甲基殼聚糖（6-O-CMC）對體外培養的人增生性瘢痕成纖維細胞（hypertrophic scar fibrob lasts，HSFBs ）轉化生長因子-β1 (transforming growth factor-beta1，TGF-β1) 蛋白及mRNA表達的影響，在分子水平上探討其抑制增生性瘢痕生長的作用機制。 方法：體外培養人HSFBs，選取第3～5代細胞進行下一步實驗。實驗分組采用含不同濃度6-O-CMC（0，100，200，400μg/ml）的DMEM培養液分別進行培養。培養24h后，顯微鏡下觀察各組HSFBs形態及生長情況。收集細胞培養上清，運用雙抗體夾心ELISA法檢測各組TGF-β1蛋白表達水平。運用熒光定量RT-PCR技術檢測各組TGF-β1 mRNA表達水平。 結果：與空白組相比，三個藥物劑量組HSFBs TGF-β1蛋白及mRNA的表達均減少（P<0.05），藥物濃度越高表達量越低（P<0.05），且TGF-β1 蛋白及mRNA表達的變化具有一致性。 結論：6-O-CMC有抑制體外培養的人HSFBs TGF-β1表達的作用，初步探討了6-O-CMC發揮抑制增生性瘢痕生長的作用機制，為羧甲基殼聚糖類藥物的開發利用提供理論依據。

[關鍵詞]6-O-羧甲基殼聚糖；增生性瘢痕成纖維細胞；TGF-β1；ELISA；熒光定量RT-PCR

[中圖分類號]R619+.6[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）02-0240-03

Effects of 6-O-carboxymethyl-chitosan on the expression of TGF-β1 in human hypertrophic scar fibroblasts

WU Dan1，KUANG Rui-xia2，WANG Zhi-guo2，CHEN Lu2，ZHOU Ming1，HUANG Hong-jie1

(1.Medical College of Qingdao University，Qingdao 266021，Shandong，China； 2.Department of Plastic Surgery，The Affiliated Hospital of Medical College Qingdao University，Qingdao 266013，Shandong， China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of 6-O-carboxymethyl-chitosan (6-O-CMC) with different concentrations on the expression of transforming growth factor-beta1 (TGF-β1) in human hypertrophic scar fibroblasts (HSFBs) in vitro.MethodsHSFBs were cultured in vitro，and the 3～5 generation cells were chose to the next experiment. The DMEM medium with different concentrations of 6-O-CMC (100，200，400ug/ml) were used in the experimental groups， and the control group without 6-O-CMC. After 24 hours， cell morphology and growth state of HSFBs were observed under the microscope. The expression of TGF-β1 protein was detected by ELISA. The expression of TGF-β1 mRNA was was detected by Real-time RT-PCR. ResultsCompared with the control group， the expressions of HSFBs TGF-β1 protein and mRNA in the other groups all reduced obviously (P<0.05). Concentration and expression were in inverse proportion(P<0.05). The expression of TGF-β1 protein and mRNA are on the same direction.Conclusions6-O-CMC could suppress the expression of HSFBs TGF-β1.We exploring the mechanism of 6-O-CMC in treating hypertrophic scar，which provides theoretical basis for the development and utilization of new drugs.

Key words:6-O-carboxymethyl-chitosan；hypertrophic scar fibroblasts；TGF-β1；ELISA；Real-time RT-PCR

增生性瘢痕(hypertrophic scar， HS)的發病機制尚不完全清楚。組織學上以皮膚創傷愈合過程中成纖維細胞異常增生及大量的膠原合成沉積為特征。在HS病理過程中，TGF-β1被認為起著關鍵性的作用，它不僅可以加速成纖維細胞的增殖，還可促進膠原的蛋白合成[1-2]。因此，拮抗TGF-β1作用或減少其表達的藥物可能對HS有治療作用。有研究表明，羧甲基殼多糖對體外培養的瘢痕疙瘩及增生性瘢痕成纖維細胞增殖和膠原合成有明顯的抑制作用[3-4]，但其通過那些因子如何發揮作用尚需深入研究。本實驗通過觀察不同濃度6-O-CMC對TGF-β1蛋白及 mRNA表達水平的影響，在分子水平上探討其抑制HS形成的作用機制。

1材料和方法

1.1 主要材料和儀器：6-O-CMC粉末（中國海洋大學惠贈）； DMEM（美國Gibco公司）；胎牛血清（北京華美生物制劑公司）； ELASE試劑盒（RD）；Thizol試劑盒（美國Invitrogen公司）；SYBR Premix Script 逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司）；7500型熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad 公司)；醫用凈化工作臺；CO2培養箱 ；倒置相差顯微鏡。

1.2 標本來源：標本為HS組織塊10塊，分別來自青島大學醫學院附屬醫院整形外科的10例患者。選擇標準：HS患者10例，男5例，女5例，年齡12～40歲，病程10～18個月。所有瘢痕均呈紅色，質硬， 高出周圍正常皮膚1cm以上，患者均有瘢痕區瘙癢或疼痛等不適。瘢痕處于增生活躍期?；颊邿o結締組織疾病或可能影響結締組織代謝的其他疾??；無心、肺、肝、腎等慢性疾?。?個月內未使用類固醇激素類藥物、抗腫瘤藥物等，且未曾接受放療。

1.3HSFBs的原代及傳代培養：稱取手術切除的增生性瘢痕組織塊約5g，去除表皮及皮下脂肪，在無菌條件下漂洗、消毒，留白色質韌真皮膠原組織備用。原代培養采用組織塊培養法，具體方法參照文獻[5-6]進行，待細胞融合至80%時，常規消化、傳代。實驗選用第3～5代細胞。

1.46-O-CMC對HSFBs生長及形態的影響：以2×105個/ml的細胞密度分別接種于24孔培養板，每孔1ml，37℃、5%CO2培養箱中培養12h后，按分組加入不同濃度的培養液，繼續培養24h，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況。

1.5 ELISA法測定TGF-β1蛋白表達水平：以1×106個/ml的細胞密度分別接種于6孔培養板，每孔2ml，37℃、5%CO2培養箱中培養12h后，按分組加入不同濃度的培養液。繼續培養48h后收集培養上清。雙抗體夾心ELISA法檢測TGF-β1蛋白水平，嚴格按照試劑盒說明書測定吸光度并繪制標準曲線。

1.6 引物設計與合成（上海生工生物技術有限公司完成）：

TGF-β1：上游引物：5'-ACCGGCCTTTCCTGCTTCT-3'；下游引物：5'-GGTCCTTGCGGAAGTCAATGT-3'；產物長度：156bp。

內參β-actin：上游引物：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'；下游引物：5' -CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'；產物長度：205bp。

1.7 總RNA的提取：以1×106個/ml的細胞密度分別接種于6孔培養板，每孔2ml，37℃、5%CO2培養箱中培養12h后，按分組加入不同濃度的培養液。繼續培養48h ，應用Trizol試劑盒提取的總RNA（方法按說明書進行）；并用紫外分光光度計定量，A260/A280值≥1.8的進入下一步實驗。

1.8 熒光定量PCR 擴增：逆轉錄反應（合成cDNA）嚴格按照試劑盒操作說明進行；PCR 擴增反應體系(20μl) ：SYBR Premix Ex Taq II（10μl），PCR Forward Primer (0.8μl)， PCR Reverse Primer(0.8μl)， dH2O (6.4μl)， cDNA (2μl)。反應條件：95℃30s，95℃5s， 60℃45s，共40 個循環。

以β-actin為內參照，采用相對定量法，利用Ct值計算TGF-β1mRNA 的相對量。

用熒光定量PCR常用公式進行運算：

相對表達量=2-△△Ct

其中：△△Ct=[CT（待測基因）-CT（待測組β-actin）]-[CT（對照基因）-CT（對照組β-actin）]

1.9統計學方法：數據用SPSS 18.0 統計軟件處理，計量資料用表示；所有濃度組之間運用單因素方差分析進行比較，各組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（Least Significant Difference，LSD法），P<0.05 表示有統計學意義。

2結果

2.1 6-O-CMC 對HSFBs生長及形態的影響：空白組細胞多呈典型的長梭形，胞體較大，胞漿豐富，生長旺盛，連接緊密，走向趨于一致，偶有有交叉重疊。藥物組，隨著6-O-CMC濃度的升高，細胞間出現空隙并逐漸擴大，胞體變小，梭狀突起回縮，細胞雙極變得尖細，部分細胞呈單極或不規則形態生長，部分細胞脫落，懸浮于培養液（圖1）。

2.2 ELISA測定TGF-β1蛋白表達水平：與空白組相比，各藥物組TGF-β1蛋白表達量均降低（P<0.05），藥物濃度越高，表達量越低（P<0.05）（圖2，表2）。

2.3 熒光強度曲線：熒光PCR儀在擴增過程中，會自動記錄每個循環的熒光強度。在最佳實驗條件，相同擴增效率的前提下，反應體系產生一定強度的熒光信號所需的擴增循環數（Ct 值）與反應體系中的原始模板數（cDNA）成反比。通過對熒光信號及擴增進程的實時監測， 以熒光強度與循環數建立坐標， 標本呈現典型的S 形曲線（圖3）。

2.4 初始cDNA相對量：根據熒光強度曲線中的Ct值，由上述公式算出初始cDNA 的相對量多少，即可代表原始TGF-β1 mRNA表達量多少。 結果顯示，與空白組相比，各藥物組TGF-β1 mRNA的表達量均減少（P<0.05），且藥物濃度越高，表達量越低（表1）（P<0.05）。

3討論

病理性瘢痕的防治一直是整形外科的難題之一。目前，主要應用藥物局部注射治療。治療藥物主要包括皮質激素類藥、抗腫瘤藥、免疫調節類藥物和中藥制劑等。但是，這些藥物的毒副作用較大，難以在臨床廣泛應用。所以，在天然產物中尋找藥理作用明確且無明顯毒副作用的活性單體，一直是目前研究的熱點。

殼聚糖(chitosan)是地球上蘊藏量僅次于纖維素的天然高分子化合物， 是目前已知的天然多糖中唯一的堿性多糖，它具有良好的生物相容性、生物降解性、無毒及抗菌性等特點，在生物醫學領域的應用日益廣泛[7-8]。6-O-CMC是殼聚糖經羧甲基化而得的一種水溶性多糖，與殼聚糖相比，其水溶性明顯提高， 在醫藥方面的用途更加廣泛[9]。研究表明羧甲基殼多糖對體外培養的人瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和膠原合成有抑制作用[10]，對角質細胞生長有促進作用[11]。6-O-CMC局部注射對兔耳增生性瘢痕的抑制作用與曲安奈德相近，局部注射能夠抑制兔耳增生性瘢痕[12]。這些均提示羧甲基殼聚糖在瘢痕治療領域有廣闊前景。

本實驗基于以上研究，著眼于進一步探究6-O-CMC發揮抑制增生性瘢痕作用的機制。選擇TGF-β1為檢測指標，因其為HS發生發展的重要調節因子。它在HS組織中的表達與正常皮膚組織和正常術后瘢痕組織相比具有顯著差異，并在HS發展的早期階段起著關鍵性作用[13]。實驗以體外培養的人HSFBs為靶細胞，采用ELISE及熒光定量RT-PCR技術檢測不同濃度6-O-CMC對TGF-β1蛋白及 mRNA表達的影響。實驗結果顯示，與空白組相比，6-O-CMC三個藥物濃度組對HSFBs TGF-β1蛋白及mRNA的表達均有抑制作用，且隨著藥物濃度的增大，抑制作用增強；TGF-β1蛋白及mRNA表達量的變化具有一致性。這提示6-O-CMC可能通過抑制HSFBs TGF-β1 mRNA的表達進而減少TGF-β1蛋白的表達，最終作用于HS組織，抑制其自身成纖維細胞的增值和膠原合成，此過程有些類似于正反饋作用。但是，6-O-CMC通過何種傳導途徑作用于HSFBs TGF-β1轉錄過程而減少其mRNA表達，以及6-O-CMC最佳作用濃度和作用時間確定尚需后續研究進一步確定。

總而言之，通過本實驗研究證明6-O-CMC對HSFBs TGF-β1蛋白及mRNA的表達均有抑制作用，在分子水平上初步探討了6-O-CMC對HSFBs的作用機制，為羧甲基殼聚糖類藥物的開發利用提供了理論依據。

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[收稿日期]2010-11-03[修回日期]2011-01-13

編輯/張惠娟