大鼠全腦暫時性腦缺血模型的復制

　　[摘要] 大鼠全腦暫時性腦缺血模型復制是進行動脈結扎（4—V0），其中兩條椎動脈（VA）用電凝針灼燒成永久性堵塞，兩條頸總動脈（CCA）分離后，用顯微動脈夾夾住雙側的頸動脈，使大鼠腦部供血完全阻斷至實驗所需的時間，用腦電圖（EEG）驗證，幾乎成一直線，說明大鼠腦完全缺血。缺血時間達到實驗所需的時間后，松開動脈夾，讓靜總動脈血重新流動，使大鼠全腦再灌注（re-perfusion）。本實驗證明該模型的復制動物本身必須有較高的級別，較好的體質。因為腦缺血會造成腦組織一定的損傷，而且再灌注還會使受損傷的程度進一步加深。在缺血和再灌注過程中，主要是利用DNA的損傷，一些轉錄因子和蛋白質表達發生改變的特點，來研究人類腦缺血和發病機制和治療機理。
　　[關鍵詞] 腦缺血；椎動脈結扎；靜總動脈結扎；再灌注
　　
　　腦血管疾病已成為世界上危害人類健康的第三大疾病，嚴重危害人類健康，發病率已達人群的104.53/10萬[1]。缺血性腦血管疾病（ICVD）發病率有逐年增高的趨勢，腦中風發病后，死亡率達56.6%～80%，而且即使不死亡也留下嚴重的后遺癥，嚴重影響病人和家屬的生活質量。所以人類腦血管疾病的研究已成為人們迫切的問題。生命科學是建立在實驗動物基礎上的真正科學，21世紀是鼠的世紀，在人類研究生命科學中，鼠是人們的代替者。該實驗就是用大鼠全腦暫時性腦缺血模型來模擬人類的腦血管疾病并對之進行研究。大鼠的腦血管解剖結構和功能與人類相似以及品種品系相對標準，具有良好的種內純合等特點，便于進行統計學處理，因此目前利用大鼠做腦缺血模型的有很多。大為人類對疾病的研究做出了不可估計的貢獻，可以說：“我們的生命和它有緣”。
　　一、試驗材料與方法
　　1.試驗時間
　　2009年5月13日
　　2.試驗地點
　　膠南市斯泰普高新醫學動物實驗研究中心。
　　3.動物與儀器
　　雄性Vst大鼠，體重50～300g。分四組，每組30只，分別為：2組清潔級分別由上海某單位（合格證號：滬動合格字152號）和北京某單位（許可證編號：sekkll_oo_ooo6）提供，普通級分別由江蘇某單位（合格證號為蘇動質字第020510）和長春高新醫學動物實驗研究中心（合格證號為吉動質字第020512）提供。
　　JGD—RF2射頻雙極電凝器、江灣1型C立體定位儀、微型動脈夾。
　　4.試驗方法
　　（1）麻醉。Vst大鼠用20%的水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/100g體重），5min內大鼠痛覺消失，翻正反射消失，有角膜反射。
　　（2）分離頸總動脈。將已麻醉的大鼠平鋪四肢仰臥用棉線固定在固定板上，消毒頸部，將頸部的毛剪去。在兩前肢直線上方沿腹中線切1cm 長的皮膚切口，找出跳動的頸總動脈（CCA）和與之相伴行的神經。沿血管縱向鈍性分離出頸總動脈（CCA）用棉線環頸總動脈（CCA）成1cm的線環，兩側相互交叉埋于皮下，縫合切口。
　　（3）電凝椎動脈。大鼠轉移到立體定位儀上，俯臥。頭向下傾斜30度[2-3]固定。剪去頭頸部的毛，然后消毒。在枕骨下沿背正中切1cm長的切口，切開皮膚和斜方肌，分離肌肉，找到第一頸后弓上的橫突孔，用電凝針插入2～3mm，灼斷孔中椎動脈，使之永久性阻塞，如果橫突過小，電凝針插不進去，也可用7號針頭輕輕旋入2～3mm，并不拔出，再用電凝針電凝針尾，使椎動脈永久性阻斷。電凝電畢后，將切口縫合。大鼠放回飼養籠中，讓其自然蘇醒，晚上不喂任何飼料，自由飲水[3]。
　　（4）缺血。以上手術后24h，大鼠在清醒的狀態下仰臥固定，重新打開頸部切口，用顯微動脈夾夾住雙側的頸總動脈，使大鼠腦部供血完全阻斷，大鼠先掙扎數秒后于30～60s內昏迷，放開固定，可見大鼠四肢上舉，翻正反射消失，痛覺反應消失，雙側瞳孔散大，眼球呈灰白色，身體可呈角弓反張，用腦電圖（EEG）驗證，腦電圖幾乎成直線，與對照組有明顯的區別。實驗過程中，室溫保持20℃以上。缺血時間達到所需時間后，把動脈夾松開，讓頸總動脈中的血液重新流動。整個手術過程以及動物能自主活動前，應用紅外線加熱器或電熱毯保持動物的直腸溫度為37℃左右[4]。
　　二、試驗結果
　　1.測試項目與方法
　　（1）大鼠腦部供血完全阻斷后，大鼠四肢上舉，反正發射消失，痛覺反應消失，雙側瞳孔增大，眼球呈灰白色，身體呈角弓反張，用腦電圖驗證，腦電圖幾乎成一直線。
　　（2）試驗證明，兩種清潔級的大鼠全腦暫時性腦缺血模型復制的成功率明顯高于普通級。
　　2.試驗結果
　　大鼠具有腦部血管解剖結構和功能與人類相似，品種，品系相對標準，良好的種內純合性的特點，該試驗成功的做成了大鼠全腦暫時性的缺血模型，給人們對人類腦血管疾病的研究提供了條件。
　　三、討論與結論
　　復制大鼠全腦暫時性腦缺血模型的主要目的是為了檢測該模型中的基因、轉錄因子和蛋白質表達的變化或者某種藥物的治療效果，所以缺血再灌注模型的成功與否直接影響以后試驗的進行。做該模型時要選擇質量好，耐受性好的大鼠，因為腦缺血對大鼠的腦組織損傷嚴重，而再灌注，不僅沒有使損傷的腦組織得以恢復，反而由于細胞內Ca離子超載、一氧化氮以及氧自由基等作用使損傷程度進一步加深。所以必須慎重選擇，要選擇30～60s內昏迷的大鼠，在缺血過程中，大鼠的直腸溫度要保持在36.5～37.5℃，因為已證明低溫（〈32℃）或亞低溫（32～35℃）對缺血造成腦組織損傷具有一定的保護作用[5]。而且在復灌過程中，室溫要保持22℃以上，直到大鼠清醒能自由活動。注意大鼠在缺血時若沒有昏迷，或發生振顫、翻轉以及復灌時發生癲癇、痙攣、不宜做模型，這種動物都得淘汰。
　　參考文獻
　　[1] 周光紹.基礎研究與國家目標，中國首屆“科技活動周”上的科技形式報告，2001
　　[2] pulinelli WA，Brierly JB.A new model of bilateral hemispheric schemia in the unanesthetized rat（J），stroke；1979，10（3），267～272
　　[3] Pulinelli WA，Buchan，AM，The four—vessel occusion rat model：method for complete occlusion of vertebral arteries and control of collateral iroulation[J]stroke，1998，19（7）：913～914
　　[4] 劉紅梅等。大鼠全腦缺血再灌流后腦組織P53及P21蛋白的表達[J]中國神經免疫學和神經病學雜志，1999，6（3）：140～146
　　[5] 張國瑾等、國外腦血管疾病研究進展[M]。北京：中國醫學科技出版社，2000