海星皂苷類化合物抗腫瘤分子對接研究

陳 寧，唐祉娟，劉 冰*，肖 迪，王貞妮

(1.哈爾濱商業大學 藥物工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076)

海星又名星魚，屬棘皮動物門(Echinodemata)、海星綱(Asteroidea)。海星含有大量的蛋白質、氨基酸、不飽和脂肪酸、鈣、鐵、磷等常規物質，還含有海星皂苷、海星皂素等具有特殊功效的物質。因海星中不飽和脂肪酸的含量比陸地動物高很多，適合老年人適量食用，可增強記憶力、健腦益智；且海星大部分成分都是蛋白質，分解后與人體的氨基酸比例很接近，適合體質虛弱的人適量食用，可起到補虛健體的功效。海星味咸且性平，具有厚腸止瀉、安神、和胃止痛等作用[1-3]，主要用于治療甲狀腺腫、胃痛胃酸、腹瀉、癲癇等[4]。研究發現，海星中含有皂苷、甾醇、生物堿等多種活性成分，具有抗腫瘤、降糖等多種生物活性[5-9]，在海洋中藥和保健食品的開發中具有重要的應用價值[10-11]。近年來，關于海星甾體化合物的提取及活性研究較多，尤其是對海星皂苷的研究[12]。趙君等[13]從海星殼的水提液中分離純化出水溶性海星皂苷，體外抗腫瘤活性檢測發現，所得皂苷純品對胃癌細胞SGC-7901、宮頸癌細胞HeLa、肺癌細胞A-549和肝癌細胞Bel-7402均具有顯著的抑制活性。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一類結構相關的含鋅內肽酶，介導結締組織大分子的降解。哺乳動物的MMPs家族至少由20種酶組成，根據底物特異性和結構域的結構分為4個亞類[14]。其中基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)構成MMPs家族中的明膠酶。在惡性腫瘤細胞運動的情況下，MMP-2和MMP-9具有降解基底膜和其它基質成分的能力。通過基因調控或藥物作用降低MMP-9活性的干預可影響腫瘤細胞，因此，降低MMP-9活性可能是抗腫瘤的關鍵機制。由于MMPs在重建結締組織模型中的核心作用，研究人員對其作為廣泛退行性和炎癥性疾病(如關節炎和動脈粥樣硬化)治療干預的靶點產生了極大興趣。根據MMP-9的結構能夠為這一重要的抗腫瘤靶點設計有效和特異的抑制劑[15]。

作者通過檢索數據庫收集海星皂苷類化合物，建立小分子配體庫，基于MMP-9的晶體結構，利用分子對接技術篩選出與MMP-9有較強結合作用的海星皂苷類化合物，并通過Western blot檢測海星皂苷類化合物對人乳腺癌細胞MCF-7的MMP-9蛋白表達的影響。

1 實驗

1.1 技術平臺

蛋白質晶體結構數據庫(RSCB PDB http://www.rcsb.org)，小分子化合物結構數據庫(SciFinder)，Pymol軟件，AutoDock Vina分子對接程序。所有計算均在DELLT5820上執行。

1.2 小分子配體庫的建立

海星皂苷類化合物從SciFinder數據庫[16-33]中獲得，利用Chem3D軟件將其轉換為mol2格式。對全部小分子配體，用分子程序MM2的最小能量模塊進行優化，得到的穩定優勢構象以mol2格式保存。利用Penbabel軟件對mol2格式的小分子配體進行批量加工，并轉換成pdbqt格式保存。

1.3 對接參數的確定

使用分子模擬軟件Sybyl進行分子對接研究，探討海星皂苷類化合物與MMP-9的作用模式。從PDB數據庫中下載得到MMP-9的晶體結構。使用Notepad去除反異羥肟酸酯抑制劑和HOH等小分子，加入氫氣，計算點電荷并設置原子類型，根據受體蛋白復合物中的配體和活性口袋確定對接活性部位和對接參數，保存加工后的蛋白。

1.4 分子對接

使用AutoGrid計算能量格點，根據原配體的坐標文件設置Grid Box中心坐標為：MMP-9(1GKC)：60.455、25.057、113.976，共有50×50×50個網格點，每個網格點的距離為0.037 5 nm。使用AutoDock搜索網格范圍內受體，采用拉馬克遺傳算法進行構象搜索，能量評定最大次數為2 500 000，每個小分子配體都設定得到9個構象，計算CPU選擇為10，其它參數選擇默認值。運行AutoGrid進行網格點中相關能量的計算[34-36]。

使用AutoDock Vina[34-35]對MMP-9活性中心進行配體庫的構象搜索，采用AutoDock 4.2搜索算法進行半柔性對接[37]。

1.5 數據與作用模式分析

采用Pymol軟件進行分子對接打分及作用模式分析。

1.6 Western blot檢測

取對數生長期的人乳腺癌細胞MCF-7(5×106個)，用PBS緩沖液洗滌1次，分別加入劑量為7 μmol·L-1、14 μmol·L-1、21 μmol·L-1的化合物28/40/44，培養48 h；細胞裂解物立即于95 ℃下變性10 min；將細胞裂解液(25 μL)裝載到7.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，并在0.192 mol·L-1甘氨酸、0.025 mol·L-1Tris和20%甲醇中轉印到PVDF膜上，冰上轉膜1.5 h，用pH值7.5的5%脫脂牛奶封閉2 h，用TBS緩沖液/0.05%吐溫20溶液洗滌3次，每次15 min；用TBST緩沖液按1∶200比例稀釋；再用TBS緩沖液/0.05%吐溫20溶液洗滌3次，每次15 min，斑點消失，在室溫下用1∶10000稀釋的過氧化物酶結合二級抗體；用TBS緩沖液/吐溫20溶液洗滌3次后，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為參比進行顯色及統計學分析。

2 結果與討論

2.1 小分子配體庫的構建

從SciFinder數據庫獲得60個海星皂苷類化合物，構建小分子配體庫，其中與MMP-9對接效果較好的30個化合物的結構式如圖1所示。

圖1 與MMP-9對接效果較好的30個海星皂苷類化合物Fig.1 Thirty starfish saponins with good docking effect to MMP-9

2.2 對接方法的準確性驗證

采用反異羥肟酸酯抑制劑與MMP-9進行對接，驗證AutoDock 4.2參數設置的準確性。將MMP-9(1GKC)結構活性中心所結合的反異羥肟酸酯抑制劑取出作為配體，與刪去了此配體的MMP-9(1GKC)重新對接(圖2)。結果顯示，對接結合自由能最低為-8.9 kcal·mol-1，其均方根偏差RMSD值為1.99(一般認為RMSD值<2，配體與受體可有效對接[33-34])，可見反異羥肟酸酯抑制劑已成功嵌入MMP-9表面的活性中心，表明本實驗的參數設置合適，能較合理地模擬抑制劑與酶在活性中心的結合構象，對接方法可信[38]。

圖2 反異羥肟酸酯抑制劑與MMP-9的對接模式

2.3 分子對接打分

將60個海星皂苷類化合物與MMP-9對接，其中對接效果較好(對接打分<-7)的30個化合物的打分結果列于表1。

表1 海星皂苷類化合物與MMP-9的對接打分

2.4 分子對接作用模式分析

采用AutoDock和Pymol軟件分析60個海星皂苷類化合物與MMP-9的對接模式。發現在MMP-9活性中心的氨基酸殘基中，Gly186、Leu188、His401、His405、His411、Pro421有可能與海星皂苷苷元結構中的羰基、羥基及糖上的羥基形成氫鍵，從而在對接時發揮重要作用，尤其是His401、His411、Pro421側鏈上的O原子和N原子很容易與海星皂苷小分子配體相互作用形成氫鍵。另外，非結合相互作用(如范德華力和靜電相互作用)在MMP-9活性中心與海星皂苷小分子配體之間形成穩定的結合構象方面也起著非常重要的作用。海星皂苷類化合物3、14、28、40、42、44與MMP-9具有較強的結合作用，它們進入MMP-9活性中心的關鍵口袋，并與關鍵氨基酸殘基相互作用(圖3)。

圖3 海星皂苷類化合物3、14、28、40、42、44與MMP-9的對接模式Fig.3 Docking mode of starfish saponins 3,14,28,40,42,and 44 with MMP-9

2.5 海星皂苷類化合物28、40、44對人乳腺癌細胞MCF-7的MMP-9蛋白表達的影響(圖4)

從圖4可以看出，人乳腺癌細胞MCF-7在給藥(海星皂苷類化合物28、40、44，用量10 μg·mL-1)48 h后，MMP-9蛋白表達量明顯減少。

圖4 海星皂苷類化合物28、40、44對人乳腺癌細胞MCF-7的MMP-9蛋白表達的影響Fig.4 Effect of starfish saponins 28,40,and 44 on expression of MMP-9 protein in human breast cancer cells MCF-7

3 結論

通過檢索數據庫收集海星皂苷類化合物，建立小分子配體庫，基于MMP-9的晶體結構，利用分子對接技術篩選出與MMP-9有較強結合作用的海星皂苷類化合物3、14、28、40、42、44，它們是海星發揮抗腫瘤作用的關鍵化合物；通過Western blot檢測，發現海星皂苷類化合物28、40、44可使人乳腺癌細胞MCF-7的MMP-9蛋白表達量減少。為海星抗腫瘤作用機制研究奠定了基礎。