豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的二級結構和B細胞抗原表位的預測

摘要：以TGEV(豬傳染性胃腸炎病毒)基因組序列為基礎，運用Gamier-Robson、chou-Fasman和Karplus-Schulz方法預測其s蛋白的二級結構，運用Kyte-Doolittle方法對s蛋白的親水性進行分析，并分別運用Jameson-Wolf方法和Emini方法預測了其抗原指數和表面可及性，最后結合吳玉章的方法綜合分析預測了其B細胞抗原表位。結果顯示，a螺旋數量少且分散，B折疊占據面積較大，柔性區域主要集中在N端第22～30、45～76、100～172、239～301、348～419、451～519、541～633、645～720、746～796、822～887、921～986、1052～120l、1239～1384、1434～1445區段。s蛋白可能的B細胞抗原位點是N端第20～32、44～54、69～78、97～106、635～655、781～803、949～994、1307～1328、1346～1362、1432～1448區段，這些區段內部或附近都有柔性區域存在，可作為s蛋白的抗原優勢表位。

關鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒；S蛋白；二級結構；B細胞抗原表位

中圖分類號：Q518.1 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942(2010)12—0006—05

豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroen-terids virus of swine，TGEV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是引起豬傳染性胃腸炎的主要病原，可導致7～10日齡以內仔豬嘔吐、嚴重腹瀉和高死亡率(通常100％)，給養豬業帶來巨大經濟損失。

TGEV病毒粒子的直徑為90～200nm，呈球形或橢球形，具有囊膜，囊膜外有一層呈花瓣狀的纖突(spike，S)。TGEV基因組為不分段的單股正鏈RNA，可分為7個區，每個區有一個或多個開放閱讀框(ORF)，整個基因組的順序為：5′－20RFla－ORF1b3／S－ORF3a－ORF3b－SM－M－N－ORF7－3′。ORF2基因編碼的纖突糖蛋白(s蛋白)是唯一能誘導機體產生中和抗體的結構蛋白。S基因全長4.35×10bp，翻譯產物為1450個氨基酸殘基，分子質量約為158ku。S蛋白至少有五種作用：(1)攜帶主要的B淋巴細胞抗原決定簇，是唯一能誘導產生中和抗體和提供免疫保護作用的結構蛋白；(2)含有宿主細胞氨肽酶受體(PAPH)的識別位點，決定其宿主組織細胞親嗜性；(3)決定TGEV的毒力；(4)具有融細胞膜的作用，協助病毒核蛋白進入宿主細胞；(5)決定TGEV的血凝活性。本研究根據TGEV病毒s蛋白基因推導的氨基酸序列，利用免疫信息學技術預測S蛋白的二級結構和B細胞抗原表位，為合理選擇B細胞優勢表位，進而為研究s蛋白特征、單克隆抗體制備和研制表位疫苗奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

TGEV分析參考株來自GenBank，登陸序列號為DQ811789，其S蛋白共由1450個氨基酸殘基組成(見圖1)。

1.2 方法

1.2.1 S蛋白的二級結構預測 運用Gamier-Robson、Chou-Fasmant和Karplus-Schulz方法預測TGEV S蛋白的二級結構。

1.2.2 TGEV S蛋白B細胞抗原表位的預測運用Kyte-Doolitfle方法對s蛋白的親水性進行分析，用Jameson-Wolf方法預測s蛋白的抗原指數，用Emini方法預測S蛋白的表面可及性。然后綜合分析，兼顧各項預測參數推斷S蛋白B細胞表位，并用吳玉章等建立的抗原性指數(AI)對預測的表位進行綜合評判。

2 結果與分析

2.1 TGEV S蛋白二級結構的預測

運用Chou-Fasman法和Gamier-Robson法預測α螺旋、β折疊和轉角區域，兩種方法預測結果不盡相同，但大部分區域重疊(見圖2、圖3)。S蛋白的二級結構中α螺旋比較分散，沒有大面積的聚集區域，主要集中在第83～96、177～190、210～227、310～320、466～478、677～685、885～922、1137～1209、1340～1385區段；B折疊占據了較大面積，但因α螺旋、β折疊兩種結構均含有氫鍵，鍵能比較高，能夠較牢固地維持蛋白的高級結構，不易形成抗原表位。轉角區和無規則卷曲區段分布很廣。運用Karplus-Schulz方法可以預測得出柔性區域占氨基酸總數的39.1％，主要的柔性區段大致為第22～30、45～76、100～172、239～301、348～419、451～519、541～633、645～720、746～796、822～887、921～986、1052～1201、1239～1384、1434～1445區段。

2.2 S蛋白B細胞抗原表位的預測

按照Kyte-Doolittle、Jameson-Wolf、Emini方法分別預測S蛋白親水性、抗原指數和表面可能性，結果見圖4，其中高于閾值的肽段即為預測的抗原表位。Jameson-Wolf方案綜合分析了蛋白的親水性、表面可及性、可塑性及二級結構，根據一定的公式計算抗原指數，是常采用的方案之一。預測結果顯示N端第17～32、41～54、66～78、97～106、118～175、198～215、236～259、320～326、349～357、392～400、414-424、449～457、504～517、537～547、558～710、781～793、822～831、866～877、921～941、949～994：1011～1016、1057～1064、1080～1094、1131～1153、1167～1199、1238～1247、1258～1288、1318～1328、1345～1362、1432～1448區段為抗原指數較高的區域。

將各種方案預測的可能性表位列于表1。從表中可以發現應用不同的預測方法，其預測的抗原表位個數和抗原表位可能出現的肽段有所不同。但S蛋白第20～32、44～54、69～78、97～106、118～175、239～259、558～623、635～655、660～710、781～803、949～994、1166～1199、1238～1287、1307～1328、1346～1362、1432～1448區段顯示多種預測方法基本一致，有較好的親水性、可及性和較高的抗原指數，并且在二級結構上含有易形成抗原表位的轉角和不規則卷曲結構，因此B細胞抗原表位可能在這些區域內或者附近。

吳玉章根據98個表位分析病毒蛋白B細胞表位的殘基構成，并與參照蛋白的氨基酸構成相比較，建立了20種殘基的抗原指數(antigenic in-dex，AI)。結合表l中的數據，用該方法計算s蛋白可能的B細胞表位的平均抗原指數，結果見表2，可見S蛋白20～32、44～54、69～78、97～106、635～655、781～803、949～994、1307～1328、1346～1362、1432～1448區段的抗原指數較高，提示它們可能是B細胞表位的優勢區段。

3 討論

自親水性參數用于預測抗原表位以來，隨著分子免疫學與免疫信息學的發展，現在已有多種算法用于B細胞表位的預測，主要有二級結構、親水性、表面可及性、抗原指數以及柔韌性等參數，應用單參數預測模型，均有成功預測某種蛋白類型抗原表位的報道。但單參數預測有其局限性，就親水性和可及性而言，雖然二者是形成表位的首要條件，但并不能表示一定具有抗原性。表位的形成是多種因素綜合作用的結果，本研究綜合分析多種參數，以提高s蛋白B細胞表位預測的準確性。

Gamier－Robson方法主要用于計算特定氨基酸殘基在特定結構內部的可能性，Chou-Fas-man方法是通過序列氨基酸殘基的晶體結構來預測蛋白質的二級結構，Karplus-Schulz方法可以預測蛋白質骨架區的柔韌性。α螺旋和β折疊由于化學鍵鍵能比較高，能夠較牢固地維持蛋白的高級結構，很難與抗體結合，且經常位于蛋白質的內部，所以很少能夠成為抗原表位的所在區域。而蛋白質的轉角及無規則卷曲等柔性結構則比較松散，易發生扭曲、盤旋并容易出現在蛋白的表面，所以成為表面抗原的可能性較大。本試驗結果顯示，s蛋白的柔性區段分布較廣，各區段之間相距較近，容易形成大面積的扭曲和盤旋，為B細胞抗原位點的存在提供了良好的條件。用Jameson-Wolf方法預測的抗原指數可以作為B細胞抗原位點的證明，但是僅僅從抗原指數這一項指標來確定B細胞抗原位點有些片面，因為多肽在形成衣殼蛋白時會發生構象變化，有些抗原指數較高的區段會被外層的氨基酸殘基屏蔽，另外氨基酸的親水性大小也會影響優勢抗原表位的形成。

本文預測蛋白質二級結構和抗原表位的手段是建立在氨基酸一級結構的基礎上，忽略了氨基酸的分子間作用力，故對構象依賴性抗原表位的預測有一定局限性。單克隆抗體和疫苗的制備均與目的蛋白的二級結構和抗原表位密切相關，本試驗結果可以作為確定TGEV s蛋白潛在優勢表位的參考，為設計疫苗時人為除去基因片段中無用或有不良影響的區段，從而研制出更加高效安全的疫苗，提供了合理的基礎理論數據。