秋水仙堿處理大蔥愈傷組織誘導多倍體的研究

摘要：試驗采用秋水仙堿加入培養基和秋水仙堿溶液浸泡處理大蒜愈傷組織，經染色體數目鑒定表明，這兩種方法都能有效地誘導四倍體細胞。加入培養基法在誘導率和操作上都優于液體浸泡法。其中以在培養基中加入0.08％秋水仙堿，處理4 d的誘導效果較好，加倍率達26.0％。

關鍵詞：秋水仙堿；大蔥；愈傷組織；多倍體

中圖分類號：S633.1；S335.3 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942(2010)12—0015—03

秋水仙堿是一種化學誘變劑，它與離體培養相結合能夠加大多倍體的變異頻率。張興平等(1994)在西瓜幼胚子葉不定芽再生的前7d，在再生培養基中添加0.05％的秋水仙堿，大大提高了組織培養再生四倍體的頻率和效率。郭啟高等(2000)用秋水仙堿溶液處理培養材料并在西瓜芽再生培養基中添加6-BA，即可產生高頻率的四倍體變異。本研究利用離體培養與秋水仙堿相結合獲得了大蔥多倍體細胞，為大蔥多倍體育種奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

組織培養的外植體材料為章丘大蔥的成熟種子；離體誘導多倍體的材料為章丘大蔥成熟胚培養繼代一次的愈傷組織；細胞學觀察取培養中分裂旺盛的愈傷組織。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌外植體的獲得 先將種子用自來水沖洗10min，在無菌室超凈工作臺上用75％酒精漂洗30～60s，轉至0.1％升汞中消毒8～10min，最后用無菌水沖洗3～4次，在無菌狀態下催芽，至芽長1cm左右時待用。

1.2.2 培養條件 以MS培養基為基本培養基，另外分別添加2，4-D、KT、6-BA、NAA，蔗糖3％，瓊脂0.9％，pH5.9～6.0，于高壓自動滅菌鍋中消毒20min。培養溫度為(25±1)℃，除愈傷組織誘導在黑暗條件下外，光照均為3000lx，每天光照12h。

誘導培養基：MS+2.0mg／L 2，4-D+1.0mg／L 6-BA

分化培養基：MS+1.5mg／L6-BA

1.2.3 處理方法 秋水仙堿處理按陳伯君等(2000)采用的兩種處理方法：

(1)秋水仙堿加入培養基法：從繼代培養中選擇淺黃色的愈傷組織切成約0.2m³左右的小塊，轉入含有秋水仙堿濃度分別為0.04％、0.06％、0.08％、0.10％、0.12％的愈傷組織誘導培養基中，處理時間分別為2、4、6d，共15個組合。處理完畢后，轉入不含秋水仙堿的分化培養基中繼續培養。

(2)秋水仙堿溶液浸泡法：將秋水仙堿配制成濃度分別為0.02％、0.04％、0.06％、0.08％的溶液，并進行消毒滅菌，將愈傷組織切成0.2 em3的小塊，在上述溶液中分別浸泡4、8、12h后取出，無菌水沖洗3～4次后，轉入分化培養基中培養。

1.2.4 愈傷組織染色體鑒定 所有處理后的愈傷組織在不含秋水仙堿的愈傷組織分化培養基中培養5d后，在無菌條件下取部分愈傷組織進行染色體鑒定。用顯微鏡隨機觀察200個分裂相細胞，統計多倍體細胞數，計算加倍率。

2 結果與分析

2.1 秋水仙堿加入培養基法對愈傷組織多倍體的誘導

由表1可以看出，秋水仙堿處理后，不同處理均得到了四倍體細胞，其中以0.08％的秋水仙堿處理4d效果最好，加倍率達26.0％。秋水仙堿濃度過高過低均不利于提高愈傷組織細胞的加倍率。但也看出，秋水仙堿處理濃度低、時間長或濃度高、時間短時，也有利于提高愈傷組織細胞的加倍率。

2.2 秋水仙堿溶液浸泡處理對愈傷組織多倍體的誘導

由表2可以看出，秋水仙堿溶液浸泡處理法對愈傷組織染色體加倍的誘導率稍低于秋水仙堿加入培養基法，但變化規律基本一致。秋水仙堿的處理濃度以0.06％為佳。浸泡時間以8h為好。用0.06％的秋水仙堿浸泡愈傷組織8h的多倍體誘變率最高，達到22.5％，繼續升高濃度或延長時間，加倍效果呈下降趨勢。

3 討論與結論

3.1 秋水仙堿處理愈傷組織的方法

本試驗采用了秋水仙堿加入培養基法和浸泡法處理愈傷組織，二者均獲得了一定頻率的多倍體細胞。經過比較，發現秋水仙堿溶液浸泡法處理的死亡率較高，可能因浸泡法藥液較容易滲入愈傷組織細胞中，從而抑制紡錘絲的形成，并且處理中浸泡在藥液中易造成缺氧而死亡，再加上秋水仙堿的毒害性，造成死亡率較高。另外，浸泡法在愈傷組織轉移過程中需要經過多次沖洗，增加了受污染的幾率。秋水仙堿加入培養基法無論在誘導率還是在存活率上都優于浸泡法，這與王鴻鶴等(1999)的觀點一致。但是，也有人認為浸泡法效果更佳，還有的認為將愈傷組織先浸泡，然后接種于含一定濃度的秋水仙堿的培養基中效果更好，這可能與不同試驗材料有關。

3.2 秋水仙堿最佳處理濃度與時間組合的選擇

試驗中發現，在離體材料的誘導中，秋水仙堿濃度高，處理時間長，導致材料死亡率高，但多倍體誘變率并不一定提高；而濃度低，處理時間短，則不易得到加倍的植株；只有在適宜的處理濃度和時間才能獲得較高的誘導率，這與張承妹等(1995)在黃瓜四倍體研究中所得結論一致。本試驗結果表明，用0.08％的秋水仙堿濃度處理4d效果較好，四倍體誘導率達26.0％。但也有人認為，用高濃度的秋水仙堿進行短時間處理效果好，如張俊蓮(1995)對當歸的愈傷組織進行誘導時發現秋水仙堿高濃度與較短時間的處理組合最好。上述結果表明，不同材料在加倍處理時方法可能不完全相同。