香菇胞外酶活性變化及其與農藝性狀的相關性分析

摘要：室內測定結果表明，纖維素酶、淀粉酶、鄰苯二酚氧化酶在菌絲生長期、轉色期、出菇期活性持續增高，愈創木酚氧化酶與漆酶活性在轉色期達到峰值，在出菇期活性下降。纖維索酶與淀粉酶呈顯著正相關。菌絲期漆酶活性與產量呈極顯著正相關，與轉色期呈顯著負相關；轉色期纖維素酶、淀粉酶、漆酶相互呈顯著正相關，漆酶與產量呈顯著正相關，與出菇期呈顯著負相關。出菇期中的各種酶活性與香菇農藝性狀間無顯著相關性。

關鍵詞：香菇；胞外酶；農藝性狀；相關性

中圖分類號：S646.1 20.1 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942(2010)12—0011—04

香菇[Lentinus edodes(Berk.)sing.]是優良的食藥兼用菌，有增強人體免疫力、降血脂、抗病毒等作用。作為白腐菌的一種，香菇主要栽培基質是木屑，能夠通過胞外酶作用降解木質素、纖維素，并將其轉化為蛋白質、多糖等。香菇的栽培不僅大量降解了木質素、纖維素，為人類提供了食物和多種藥用成分，而且能夠帶來巨大的經濟效益。據中國食用菌協會統計，2002年中國香菇產量約為200×10⁴t，占世界總產量的80％以上，直接產值達66.5億元。香菇對木質素的降解和轉化是通過胞外酶的作用來完成的，其中關鍵酶為錳過氧化酶、木質素過氧化酶和漆酶這三種酶協同作用于連結木質素結構單元之間的醚鍵和酯鍵。首先使木質素分解成為單個的結構單元，在此基礎上，進一步催化苯丙烯醇之間的C-CB鍵斷成兩分子苯丙烯醇，最后苯丙烯醇斷鏈降解為小分子化合物，完成木質素的降解。

胞外酶活性與香菇菌絲生長和子實體發生有密切關系。酶活性的大小直接影響生物降解的能力。不同香菇菌株胞外酶系均有不同程度的活性，香菇胞外酶活性的動態變化與其生長發育周期有著緊密聯系，菌株木質素氧化酶系在菌絲旺盛生長時期活性達最高峰，但在子實體分化時期很快下降。在同一發育時期，愈創木酚酶、漆酶活性多高于鄰苯二酚酶的活性。研究表明，在香菇的整個生長過程中產子實體菌株的幾種酶活性均高于不產子實體的菌株，尤其在形成子實體的第二和第三階段。培養料成分的不同只影響酶活性的相對大小，而不影響酶活性變化的規律性；大部分酶隨著每一潮子實體的成熟出現一個活性峰值：營養生長階段酶活性總體上表現上升趨勢，生殖生長階段則呈下降趨勢，部分酶活性在后期喪失。香菇菌株的質量是由諸多農藝性狀構成的，對香菇農藝性狀之間的相關性、數量遺傳研究已有報道。但有關香菇菌絲體生長階段胞外酶活性與農藝性狀間的相關性研究尚未見報道。本試驗旨在研究香菇幾種胞外酶活性的動態變化及與產量等農藝性狀的相關性，為香菇的生物轉化、良種選育等研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

香菇(Lentinus edodes)L26，由山東省農業科學院土壤肥料研究所提供。

1.2 栽培試驗設計

培養基配方：雜木屑78％，麩皮20％，糖1％，石膏1％。栽培袋規格：17cm×33cm，試驗設3個小區，即重復3次，每小區100袋，隨機排列，常規管理。

1.3 樣品的采集及預處理

每小區選取菌絲體均勻生長的香菇栽培袋5個，3小區共選取15袋。將栽培袋置于超凈工作臺上解開袋口，每袋各取菌棒中心部位基質2g分別置于研缽中，每缽加入蒸餾水16ml將樣品研碎，然后將其傾入小燒杯中置于4℃的冰箱內浸提16h。

1.4 酶液的提取

將15個小燒杯內的試樣過濾，所得到的濾液即為測定所需要的酶液。每一小燒杯內的濾液分到兩支試管中，其中一管置于沸水浴滅活10min，作為比色對照。

1.5 菌絲體酶活力的測定

1.5.1 纖維素酶活力的測定 在試管中加入0.5％的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na2)溶液1.5ml，加稀釋10倍的酶液0.5ml，50℃水浴保溫30min，取出后立即加入DNS試劑1.5ml，煮沸5min，取出冷卻后加蒸餾水至25ml，混勻，然后于520nm處測OD值(每只試管測3次，下同)。酶活力單位(u)以樣品中所含酶反應30min后光密度改變值(AOD)的O.01表示。

1.5.2 淀粉酶活力的檢測 在試管中加入0.5％的可溶性淀粉溶液1.5ml，加稀釋10倍的酶液0.5 ml，40℃水浴保溫30min，取出后立即加入DNS試劑1.5ml。煮沸5min，取出冷卻后加蒸餾水至25 ml，混勻，然后于520nm處測OD值。酶活力單位(u)以樣品中所含酶反應30min后光密度改變值(AOD)的0.01表示。

1.5.3 木質素降解酶系活力的檢測 按表1進行試驗，所有反應均在28℃的恒溫水浴中進行。準確反應30min后立即測OD值。酶活力單位以光密度改變值(AOD)的0.01表示。

1.6 不同時期酶活性與農藝性狀的相關性分析

利用DPS軟件對菌絲生長期、轉色期、出菇期的纖維素酶、淀粉酶、漆酶、愈創木酚氧化酶、鄰本二酚氧化酶的酶活性與香菇產量、轉色期、出菇期進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 胞外酶活性分析

由圖1可以看出，纖維素酶在菌絲生長初期活性較低(0.9U)，隨著培養時間的延長活性升高，在進入轉色期后迅速提高到14.0U，子實體發育時期還有繼續升高的趨勢。淀粉酶活性變化相對緩慢，由8.3u上升到15.8u，最高酶活性同纖維素酶(14.0u)相近。在轉色期、出菇期酶活性繼續提高，兩者有相似的變化規律。由圖2看出，在所測定的生長期內，漆酶、愈創木酚氧化酶、鄰苯二酚氧化酶活性變化相對復雜。在菌絲生長期漆酶、愈創木酚氧化酶活力有小幅升高，二者活性要大于鄰苯二酚氧化酶。隨著菌絲生長，各種酶活力增長減緩。進入轉色期后，漆酶和愈創木酚氧化酶活性出現較大幅度提高并達到峰值，在出菇期漆酶、愈創木酚氧化酶活性呈現下降趨勢，兩者變化規律相似，但鄰苯二酚氧化酶活性在所測定的生長期內持續升高，未表現出與漆酶、愈創木酚氧化酶相似的變化規律。

2.2 胞外酶活性與香菇農藝性狀的相關性分析

由表2看出，菌絲生長期的纖維素酶活性與淀粉酶活性有極顯著的正相關性，菌絲生長期漆酶活性與產量呈極顯著正相關，與轉色期呈顯著負相關，其他考察指標間相關性不顯著。這說明漆酶活性是菌絲生長期的關鍵因素，并且活性越高，對木質素的降解效率就越高，菌株轉色也就越早，產量越高。菌絲生長期漆酶活性對香菇轉色期及產量影響很大，但不影響香菇出菇的早晚。

轉色期纖維素酶、淀粉酶、漆酶相互呈顯著的正相關，漆酶與產量呈顯著的正相關、與出菇期呈顯著的負相關。轉色期是香菇代料栽培的關鍵時期，漆酶與產量、轉色期、出菇期的相關性表明，此階段香菇漆酶活性越高，香菇子實體產量越高，出菇期越短。菌絲生長期、轉色期的漆酶活性對香菇產量、出菇期、轉色期的影響都是顯著的。

出菇期纖維素酶與淀粉酶活性呈顯著的正相關，其他胞外酶間活性相關性不顯著。出菇期中的各種酶活性與香菇農藝性狀間沒有顯著的相關性。產量、轉色期、出菇期之間的相關性不顯著，說明香菇轉色的早晚、出菇的早晚對其產量的高低影響不大。通徑分析、灰色關聯分析表明影響產量大小的正相關的關鍵因素是出菇數量、負相關的關鍵因素是單菇的鮮重。但主成分分析研究表明，產量與出菇期有顯著的負相關，即出菇越早，產量越高，與本試驗結果不太一致，可能與分析方法的差異有關。

3 結論與討論

酶活性規律：香菇對木質素的降解主要靠胞外酶作用來完成，胞外酶種類比較多，本試驗只對纖維素酶系和木質素酶系的部分胞外酶進行了分析。香菇淀粉酶活性在菌絲生長期、轉色期、出菇期持續升高，并且淀粉酶活性與纖維素酶活性一直有著顯著的相關性，說明對淀粉的利用和對纖維素的利用是一致的，沒有時間上的先后順序。而平菇的淀粉酶活性則是前期高，隨著菌絲生長逐漸降低，然后繼續升高，并認為平菇在菌絲生長前期首先大量降解淀粉類物質。不同的變化規律是否與菌株的生物學特性及培養基有關，尚需進一步研究。

香菇菌株的木質素酶活性在菌絲生長期一直升高，在轉色期達到最高值，子實體發生時則活性下降。張曉昱(1995)報道菌絲生長時期木質素降解酶系活性高于生殖時期木質素酶系的活性，與本試驗漆酶、愈創木酚氧化酶變化一致，但鄰苯二酚氧化酶活性未呈現相似的變化。

相關性分析：漆酶活性在香菇菌絲期、轉色期同產量均有顯著的正相關，其活性應該作為香菇良種選育的重要考察指標，以期促進香菇優良菌株的先期鑒定，縮短育種周期。愈創木酚氧化酶與漆酶活性有相同的變化規律，但兩者之間卻沒有顯著的相關性，與轉色期、產量、出菇期也沒有顯著的相關性，其原因有待進一步研究。

轉色期是香菇代料栽培的關鍵一環。一般來說，菌筒轉色的快慢，顏色的深淺，色澤的明暗與出菇的早晚、稀密、大小及質量高低均有密切的關系。本試驗只研究了酶活性與轉色期的相關性，由于轉色過程中的顏色、色澤等指標均不是數量性狀，因此依托栽培經驗對轉色好壞進行判斷十分必要。