甲硝唑葡萄糖注射液注射液無菌檢查方法的驗證

【摘要】 目的 確定甲硝唑葡萄糖注射液的無菌檢查方法 。方法 按中國藥典2005年版二部無菌檢查法(附錄XI H)中薄膜過濾法進行驗證。結果 采用薄膜過濾法細菌以500ml/筒沖洗量、真菌以500ml/筒沖洗量檢查，在規定條件下敏感菌可正常生長。結論 甲硝唑注射液的無菌檢查可采用薄膜過濾法檢查(500ml/筒沖洗量)。

【關鍵詞】 甲硝唑葡萄糖注射液 無菌檢查法

Abstract:The purpose: Determine the asepsis check method of the metronidazole glucose injection. The method: Validate according to Membrane filtration method in Chinese pharmacopoeia 2005 edition sterile test (appendix XI H). The result: Checking by using film filtration bacteria， Sensitive bacteria can be normal growth under prescribed conditions. The conclusion: The asepsis check of the metroni-dazole injection can be checked by Membrane filtration method (500ml/cone flushing).

甲硝唑葡糖糖注射液用于厭氧菌感染的治療。甲硝唑對厭氧微生物有殺滅作用，它在人體中還原時生成的代謝物也具有抗厭氧菌作用，抑制細菌的脫氧核糖核酸的合成，從而干擾細菌的生長、繁殖，最終致細菌死亡。近年來，廣泛地應用于抗厭氧菌感染，對擬桿菌屬;梭形桿菌屬;梭狀芽孢桿菌屬，包括破傷風桿菌;部分真桿菌;消化球菌和消化鏈球菌等厭氧菌有較好的抗菌作用，而對需氧菌或兼性需氧菌則無抗菌作用[1]。根據中國藥典2005年版二部的規定[2]，進行藥品的無菌檢查應進行方法的驗證，依據甲硝唑葡萄糖注射液的抑菌特性，采用適宜方法消除其抑菌活性，擬建該藥品的無菌檢查方法。

1.儀器與材料

1.1儀器 HTY-601型集菌儀(杭州泰林生物技術設備有限公司)，全封閉無菌試驗過濾培養器(北京牛牛基因有限公司，批號:20091008N)。

1.2材料

1.2.1樣品 甲硝唑葡萄糖注射液。規格:250ml:0.5g:12.5g;批號:0912071;自制。

1.2.2培養基和稀釋液

北京三藥科技開發公司生產的硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和玫瑰紅鈉瓊脂培養基等。

1.2.3驗證試驗用菌種 金黃色葡萄球菌〔CMCC(B)26 003〕(第2代)、枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63501〕(第2代)、銅綠假單胞菌〔CMCC(B)10 104〕(第2代)、生孢梭菌〔CMCC(B)64 941〕(第3代)、白色念珠菌〔CMCC(B)98001〕(第3代)、黑曲霉〔CMCC(B)98 003〕(第5代)。

2.實驗與結果

2.1 菌液制備

2.1.1取經30℃～35℃培養18～24h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的肉湯培養物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5～10-7，備用。

2.1.2取經30℃～35℃培養18～24h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養基的新鮮培養物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-7備用。

2.1.3取經23℃～28℃培養24～48h的白色念珠菌液體培養物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5～10-6，備用。

2.1.4取經23℃～28℃培養5～7天的黑曲霉斜面培養物，加3～5ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量稀釋，用標準比濁管比濁，其濁度與標準比濁管相當后，取1ml稀釋后的孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-4，備用。

2.2實驗用菌液檢驗

2.2.1金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌

取上述金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌10-5～10-7稀釋液各1ml，用營養瓊脂培養基注皿，各平行測定兩皿，30℃～35℃培養48h，做活菌計。

2.2.2生孢梭菌 取上述生孢梭菌10-7稀釋液1ml加至12ml硫乙醇酸鹽液體培養基中，30℃～35℃培養18～24h，菌團應清晰可數。

2.2.3白色念珠菌和黑曲霉

取上述白色念珠菌10-5稀釋液及上述黑曲霉10-4孢子懸液各1ml，用改良馬丁瓊脂培養基注皿，各平行測定兩皿，23℃～28℃培養，逐日觀察，做活菌計數。菌落計數結果見表1。

2.3過濾與沖洗

取全封閉式無菌試驗過濾器培養器，先用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液少量潤濕濾膜，直至液體順利流出。按規定將樣品液濾入濾器，樣品液全部過濾完后，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次每筒注入沖洗液100ml，充分振搖、蕩洗筒壁，完全排空后再循環操作，沖洗總量每筒分別300ml，500ml，800ml。

2.4培養與觀察

分別將硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁液體培養基各100ml濾入相應濾器，將少于100cfu的6種試驗菌加入相應濾筒，同時作陽性和陰性對照。分別置規定溫度培養5天，逐日記錄生長狀況，觀察不同沖洗量對6株陽性代表菌的影響。試驗結果見表1～3。

討論

結果表明，甲硝唑葡萄糖注射液按規定取量，結果采用薄膜過濾法，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液以500ml/筒和800ml/筒沖洗量，試驗結果是一致的;對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉及生孢梭菌無明顯抑菌活性，均可使其正常生長。故得出甲硝唑葡萄糖注射液采用薄膜過濾法進行無菌檢查時，以pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液，以生孢梭菌為陽性對照菌，建議細菌、霉菌均采用500ml/筒的量沖洗。

參考文獻:

[1]《初探甲硝唑注射液無菌檢查方法的驗證》中華實用醫藥雜志 ，作者:闞秀燕，李 妍，楊 靜。

[2]《中華人民共和國藥典2005年版二部》.國家藥典委員會.北京:化學工業出版社，2005，附錄89-93.

(作者單位:哈藥集團三精制藥股份有限公司)