添加外源纖維素酶對土壤原生纖維素酶活性的影響

摘要：采用室內(nèi)模擬法研究了以玉米秸稈作底物，在pH6.5、溫度27℃的環(huán)境中，向土壤施加外源纖維素酶對土壤原生酶活性及其底物酶解率的影響。結(jié)果表明：加酶處理總酶活高于不加酶處理酶活，且加酶后的土壤原生酶活性在第3～7天高于不加酶的土壤原生酶活性。各處理酶活在第4天達到高峰后逐步降低。同時添加外源纖維素酶有助于提高土壤原生纖維索酶的底物酶解率。

關(guān)鍵詞：玉米秸稈；外源纖維素酶；酶活性；酶解率

中圖分類號：S154.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942(2010)07-0056-03

目前我國農(nóng)作物秸稈的利用率不高，絕大部分在路邊地頭自然腐解或燃棄，不僅浪費了寶貴的資源，而且造成了環(huán)境污染，利用生物化學方法綜合利用農(nóng)作物秸稈成為當前國內(nèi)外科學家競相開展的研究課題。土壤微生物產(chǎn)生的纖維素酶分解農(nóng)作物秸稈，最終產(chǎn)生葡萄糖，小分子的可溶性葡萄糖是大多數(shù)生物優(yōu)先利用的碳源營養(yǎng)物質(zhì)。利用土壤纖維素酶分解植物纖維素，反應(yīng)條件溫和，設(shè)備簡單，能耗低，污染小，具有較好的開發(fā)利用前景。為了探討提高土壤纖維素酶分解農(nóng)作物秸稈效率的新途徑，筆者采用室內(nèi)模擬方法，恒溫27℃、pH6.5條件下，以玉米秸稈為底物，向土壤中加入外源纖維素酶，研究其對土壤原生纖維素酶活性的影響及其底物酶解率的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤類型為棕壤，輕壤質(zhì)地，采自山東農(nóng)業(yè)大學南校區(qū)教學基地，采樣深度0～10cm。土壤的各項理化性質(zhì)為有機質(zhì)含量1.21％，全氮0.17％，全磷0.13％，有效氮68.98mg／kg，有效磷(P₂O₅)25.22mg／kg，速效鉀(K₂O)81.73mg／kg，pH值6.8。

供試纖維素酶產(chǎn)于北京房山，活力為1000U／g。

供試秸稈為當年產(chǎn)，取自泰安市郊區(qū)，其主要成分含量為全碳42.82％，全氮0.43％～0.50％，全磷0.39％，全鉀1.67％，C／N 55.79，纖維素35.27％。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 土樣風干后過2mm孔篩；玉米秸稈磨細，過2mm孔篩，干燥保存。

1.2.2 酶液制備 稱取纖維索酶1g，加水定容至100ml，先靜置1h，然后于3000r／min，離心10min，離心完畢后上清液即為1％酶液。

1.2.3 培養(yǎng)試驗設(shè)計 試驗設(shè)3因素，分別為外源纖維系酶加入量、土樣加入量與底物。外源纖維素酶加入量設(shè)2個水平，M：2ml酶液，NM：不加纖維素酶，加2ml蒸餾水；土樣加入設(shè)2個水平，加10g土與不加土；底物為加玉米秸稈與不加底物。另設(shè)不加土不加底物做對照。每處理重復3次(見表1)。

1.3 纖維素酶活力的測定

采用蒽酮比色法測定生成葡萄糖含量。標準曲線繪制：分別量取不同濃度的標準葡萄糖溶液(1ml溶液含10～200μg葡萄糖)2.5ml。加入耐熱試管并置于冰浴中，緩緩加入5ml蒽酮試劑，搖勻，再置于沸水中加熱10min。取出冷卻，于波長540～620mm處比色測定，以光密度值為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標繪制標準曲線。

操作步驟：稱取10g土壤于50ml三角瓶中，無土對照用10ml蒸餾水替代，再加入5ml磷酸緩沖液(pH值6.5)和1.5ml甲苯處理15min，再加入1％底物溶液(即0.05 g玉米秸稈+5 ml蒸餾水)5ml，有酶處理同時再加入1％酶液2ml，充分混合，在27℃恒溫箱中培養(yǎng)10d。同時做無底物對照，即只加5ml蒸餾水取代1％底物溶液5ml。在培養(yǎng)第2、4、6、8、10天分別取出1組處理，將瓶加熱至10℃終止反應(yīng)，用致密濾紙過濾并定容至50ml。取2.5ml濾液，按繪制標準曲線操作，加入蒽酮試劑顯色，并比色測定。根據(jù)標準曲線查出葡萄糖量。

加酶處理最終總酶活(土壤酶活+外源纖維素酶酶活)=處理1(M1)－對照2(CKNM)；不加酶處理土壤酶活：處理2(NM2)－對照2(CK-NM)；加酶處理土壤酶活=處理1(M1)－對照1(CKM)。

1.4 酶解率

土壤纖維素酶解率用葡萄糖生成量與底物用量的比值(％)表示。

加酶處理最終酶解率=土壤酶酶解率+外源纖維素酶酶解率；不加酶處理土壤酶酶解率=處理2(NM2)－對照2(CKNM)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源纖維素酶對土壤原生酶活性的影響

由圖1可以看出，在以玉米秸稈為底物的處理中，加酶處理總酶活(M)高于不加酶處理酶活(NM)。隨著時間的推移，各處理酶活在第4天達到高峰后逐步降低。而對于不加酶處理酶活(NM)則先是逐漸上升，在培養(yǎng)第7天后超過由土壤部分酶解所得的糖量即加酶處理土壤酶活。

LSD多重比較顯示，加酶處理總酶活與不加酶處理酶活相比差異極顯著(P<0.01)，不加酶處理酶活與加酶處理中的土壤原生酶活差異不顯著。在土酶共存的狀態(tài)下，酶活是先升高后降低的，這可能是因為土壤與酶共存狀態(tài)下酶解速率很快，在培養(yǎng)的前半段時間就將大部分秸稈酶解，在此后幾天秸稈殘留越來越少，酶解所得的糖量即酶活也逐漸降低。

2.2外源纖維素酶對土壤原生酶酶解率的影響

由圖2可以看出，在以玉米秸稈為底物的處理中，加酶處理(M)的底物酶解率明顯比同時間段的不加酶處理(NM)高，且加酶處理和不加酶處理的酶解率都是先升高后降低，這可能是因為在培養(yǎng)的前半段時間土壤與外源纖維素酶就將大部分秸稈酶解，在此后幾天秸稈殘留越來越少，酶解率隨之逐漸降低。

3 結(jié)論

綜上發(fā)現(xiàn)，以玉米秸稈為底物，恒溫27℃、pH6.5條件下，向土壤中加入外源纖維素酶，加酶處理的總酶活高于不加酶處理的酶活，且加酶后的土壤原生酶活性在第3～7天高于不加酶的土壤原生酶活性。隨著時間的推移，各處理酶活在第4天達到高峰后逐步降低。同時添加外源纖維素酶有助于提高底物酶解率。