蘆薈原生質體融合的研究

摘要：以蘆薈葉片為試材，采用酶解方法進行原生質體分離，并在此基礎上對斑紋蘆薈和不夜城蘆薈進行原生質體融合。結果表明，以蘆薈的葉肉細胞為試材，可成功分離出原生質體，而且活力較高，達90％以上。聚乙二醇(PEG)融合的結果可獲得部分融合體。蘆薈原生質體的成功分離主要取決于材料的來源、酶液的組成，另外還受酶解液的滲透壓、溫度和pH值等影響。融合的效率主要受融合劑的濃度、原生質體的生理狀態及處理的時間等影響。

關鍵詞：蘆薈；原生質體；分離；融合

中圖分類號：Q949.71ˊ8.23；Q943.1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942(2010)10-0027-03

蘆薈是百合科蘆薈屬的一種集觀賞、藥用、食用、美容和保健于一身的植物，具有極高的開發應用價值，素有“多備良藥”、“天然美容師”和“家庭醫生”等美稱。它含有多種對人體有益的物質，現已形成了一股世界性的蘆薈保健熱，從而帶動了我國蘆薈栽培產業的發展。本試驗以不夜城蘆薈和斑紋蘆薈的葉片為試材，采用酶解法分離原生質體，以聚乙二醇(PEG)誘導分離得到的原生質體進行融合，以期為蘆薈離體培養快速繁殖和采用原生質體融合技術改良蘆薈提供技術支持。

1、材料與方法

1.1 材料

不夜城蘆薈(Aloe nobilis HaW.)和斑紋蘆薈[Aloe vera L.var.chenensis(Haw.)Berger]的鮮嫩葉片

1.2 方法

1.2.1 酶解取蘆薈的鮮嫩葉片，用自來水沖洗干凈，并以70％乙醇消毒。在超凈工作臺上，葉片用0.1％升汞溶液浸泡滅菌10min(中間搖動幾次)。取出葉片，無菌蒸餾水漂洗5次。將葉片放人大培養皿中，吸去水分，葉背面朝上，用無菌鑷子小心撕去下表皮，或用解剖刀將葉片切成0.5mm的薄片。取葉片約2g置于10ml酶解液(表1)中，在25-28℃暗處酶解6-7h。另取一小片葉肉壓片，顯微鏡下觀察蘆薈的完整細胞做對照。

1.2.2 純化用200目篩網過濾酶解液，濾液經800r/min離心5min，棄去上清液。用3-4ml13％CPW液(表1)洗滌并溶解沉淀，懸液經1000r/min離心5min，留1ml上清液，其余棄之。取10ml離心管1支，注入20％蔗糖3ml，將1ml混有原生質體的上清液用滴管吸出并小心地鋪于蔗糖溶液上，1000r/min離心5-8min，將位于中間一層的原生質體用吸管小心吸出至另一離心管中。用13％CPW液洗滌1-2次，每次1000r/min離心5min，得到較為純凈的原生質體。用13％CPW液懸浮至一定密度并制片，鏡檢。

1.2.3 活力鑒定取1滴原生質體提取液在載玻片上，加入相同體積的0.5％的藏紅溶液，靜置2min后，顯微鏡觀察，并計算原生質體的活力。

原生質體的活力(％)=活的原生質體/總原生質體×100

1.2.4 原生質體的融合原生質體融合采用PEG和高Ca²⁺、高pH法。室溫將兩滴親本原生質體懸液滴在置于直徑5cm培養皿中的25mmx25mm蓋玻片上。靜置20min后從液滴邊緣加入一滴溶液A(含分子量6000的PEG40％，葡萄糖0.3mol/L，CaCl₂66mol/L，二甲亞砜10％)。再靜置20min后，制片，顯微鏡下觀察原生質體融合的情況，并計算其融合率。

融合率(％)=融合的細胞數/細胞總數×100

2、結果與分析

2.1 原生質體體系的建立

使用纖維素酶、果膠酶成功降解了蘆薈的細胞壁成分，然后經過濾、離心和漂浮3種方法相結合進一步純化，得到了較為純凈的原生質體(圖1)。

藏紅染色后觀察，呈紅色的是沒有活性的原生質體，無色的是有活性的原生質體，因為有活性的原生質體細胞膜具有選擇通透性，藏紅是拒染的，而沒有活性的原生質體細胞膜失去了選擇通透性，藏紅染料就可以進入。本試驗觀察了120個原生質體，其中有活性的為112個，計算其活力為93.3％。

研究發現，蘆薈的葉肉細胞是分離原生質體較好的材料，從葉片中可以分離出大量的比較均勻一致的原生質體。由于葉肉細胞排列疏松，酶的作用很容易到達細胞壁，而且葉肉原生質體有明顯的葉綠體存在，可為培養后雜種細胞的選擇提供天然的標記。在以葉片制備原生質體時植株的年齡和生長條件十分重要，最好選用植株上充分展開的幼嫩葉片。

植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細胞壁成分，除去細胞壁，即可得到原生質體。但是不同的材料會采用不同的酶組合，本試驗采用1％纖維素酶和1％果膠酶配合使用效果較好。

在酶解液中滲透壓的大小也會直接影響到分離原生質體的質量，因為失去了細胞壁的原生質體滲透壓很容易遭到破壞，若酶解液中的滲透壓比細胞內高時，則原生質體可能失水皺縮，相反，又會吸水脹破，因此，分離原生質體時一定要加滲透壓穩定劑(多采用甘露醇)來調節細胞內外滲透壓的平衡狀態。

另外，溫度和pH值也會影響原生質體分離的質量，若pH值偏低時，酶的活性強，原生質體分離速度快，但細胞活力較差，破壞的細胞較多；相反，若pH值偏高時，酶的活性差，原生質體分離速度慢，完整的原生質體數目較多。分離原生質體時溫度也有一定要求，一般在25-30℃之間進行，而酶活性的發揮最佳溫度在40-50℃之間，顯然這個溫度對于原生質體活性來說有點太高，原生質體容易失活。因此，在酶活性和原生質體的質量之間應該選一個比較折中的pH值和溫度。

分離獲得的原生質體是一個非常理想的實驗系統，可廣泛用于體細胞遺傳學、細胞生物學、生理學、病理學、分子生物學等領域的研究。因為它失去了外圍的細胞壁屏障，對外界環境非常敏感，很容易從外界攝取DNA、細胞器(如葉綠體、線粒體)、病毒等。

2.2 融合體的形成

PEG和高Ca²⁺、高pH法進行原生質體融合結果見圖2。先是細胞膜的融合，然后是細胞質和細胞核的融合。顯微鏡下隨機觀察了98個細胞，其中融合的有10個，計算其融合率為10.2％，

原生質體融合又稱體細胞雜交，誘導融合的方法有多種，包括化學的、物理的和生物學的方法。現在被廣泛采用并證明行之有效的融合方法是PEG、高鈣、高pH法。該方法操作簡單，對原生質體傷害較小，而且不需要特殊的儀器設備，既簡單又經濟。本研究以蘆薈分離出的原生質體為親本，對兩個近緣種進行了原生質體融合，結果獲得了一定量的融合產物。PEG之所以能誘導融合，是因為PEG含有醚鍵而具負極性，與水、蛋白質和碳水化合物等一些正極化基團能形成氫鍵。當PEG分子足夠長時，可作為鄰近原生質表面之間的分子橋而使之粘連。PEG也能連接Ca²⁺等陽離子。Ca²⁺可在一些負極化基團和PEG之間形成分子橋，因而促進粘連。在洗滌過程中，連接在原生質體膜上的PEG分子可被洗脫，這樣將引起電荷的紊亂和再分布，從而引起原生質體融合。高鈣、高pH由于增加了質膜的流動性，因而可以提高融合效率。洗滌時的滲透壓沖擊對融合也可能起作用。另外，融合效率還受親本原生質體的混合比例、融合劑的濃度、融合的時間及原生質體的生理狀態等影響。

3、結 論

以蘆薈的葉片為試材，采用酶解法可分離出原生質體，經聚乙二醇(PEG)處理，實現了原生質體的融合，融合率達10.2％。

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