高羊茅EST-SSR標記的開發及品種鑒定

摘要：利用EST-SSR分子標記對11份高羊茅(Festuca arundinacea)材料進行了品種鑒定研究。在優化DNA提取方法、擴增體系的基礎上對50對EST-SSR引物進行篩選，結果表明：有42對引物可以在高羊茅上得到有效擴增，對11份高羊茅品種的鑒定結果表明，其中12對引物具有良好的多態性，占28.6％；共檢測到86個等位基因，平均每個位點的等位基因數為4.5個，變幅為3-12。從譜帶類型上看：S3和S44引物擴增的譜帶類型最少(2種)，多態性百分率最低，為18.2％；S11引物擴增的譜帶類型最多(9種)，多態性百分率最高，為81.8％；共擴增到多態性譜帶65種，平均多態百分率為59.1％。

關鍵詞：高羊茅；品種鑒定；EST-SSR

中圖分類號：Q789；S688.403.7 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942(2010)10-O007-04

高羊茅(Festuca arundinacea)別名葦狀羊茅，屬禾本科(P0aceao)早熟禾亞科(Pooideae)早熟禾族(Poeae)羊茅屬內的Boyinae亞屬，是溫帶地區廣泛種植的六倍體多年生草坪草。作為耐熱的冷季型草坪草，不但能忍受冬季低溫，而且也能在一定程度上忍受夏季的高溫而不至于枯黃，因此適合在我國大部分地區生長，近年來已成為我國主要的草坪草之一。

我國高羊茅種子主要依靠進口。一些不法種子經營者唯利是圖，以劣質高羊茅種子充斥市場，給生產造成極大的損失，生產者、經營者對高羊茅純度檢驗的要求日益迫切。由于高羊茅是多倍體作物，其異花授粉和自交不親和性限制了經典遺傳學研究的深入開展，分子標記是解開這道難題的便利途徑。

目前已經開展的高羊茅分子標記研究包括：由Southern雜交衍生的RFLPs標記(Re-striction Fragment Length Polymorphisms，限制性片段長度多態性)和基于PCR擴增的標記，包括RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)、AFLP(Amplified FragmentsLength Polymorphism，擴增片段長度多態性)、SSR(Simple Sequence Repeats，簡單重復序列，又稱微衛星DNA)及ISSR(Inter-simple Sequence Re-peats，即簡單重復序列間擴增，或錨定SSR)等，另外PCR和RFLP結合的PCR-RFLP也已經得到應用。這些研究主要應用在遺傳圖譜構建、比較基因組作圖、系統分類親緣關系的研究、遺傳多樣性的分析和利用品種指紋圖譜進行雜種鑒定。而利用EST-SSR進行高羊茅品種鑒定尚未見報道。本研究擬對11個優良高羊茅品種的遺傳多樣性進行SSR分析，以期為高羊茅快速品種鑒定技術提供理論依據。

1、材料與方法

1.1 材料

試驗材料：從山東各地市場搜集的主栽高羊茅品種11份，分別是：Amigo、Alamo、Quest、Re-ward、王朝、凌志、維加斯、金王月、翠碧、南方選擇、爆炸組合。

引物序列：來自文獻中EST-SSR，利用DNAman軟件進行重新設計，設計原則如下：SSR序列的開始和結束位置分別距5ˊ和3ˊ端不少于20bp；引物長度19-24bp；退火溫度Tm值50-67℃。且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃；(G+C)含量30％-70％；PCR擴增產物長度100-600bp；盡量避免引物二級結構和寡二聚體的出現。最后篩選到50對引物交付上海生工生物技術服務有限公司合成。PCR所用的Mg²⁺、Taq酶、dNTP、Buffer均購自上海生工生物技術服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取高羊茅是一種常異花授粉植物。根據預備試驗單株幼苗的提取效果和文獻報道得出的有代表性的取樣量，每品種隨機選取30個生長良好的發芽7天后的單株幼嫩葉片等量混合，采用改良CTAB法和Tiangen試劑盒法提取DNA并進行比較試驗。

利用1％瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，樣品于4℃冰箱保存備用。

1.2.2 PCR反應體系的建立及優化

對Mg²⁺濃度、dNTP、引物濃度、Taq酶濃度進行4因素3水平的正交試驗，并在BIOMETRA TGRADIENT梯度PCR儀上進行引物最佳復性溫度的篩選。最適合于高羊茅SSR分析的20μl優化反應體系為：模板10ng/μl，dNTP 240μmol/L，引物濃度0.4μmol/L，Taq酶1.0 U，Mg²⁺2.5mmol/L。PCR反應程序為：94℃預變性4min；94℃變性30s，50-57℃變性30s，72℃延伸1min，共35個循環；72℃延伸5min，4℃保存。

1.3 電泳檢測

PCR產物先經3％瓊脂糖凝膠(含1％Gold-viewII)電泳檢測擴增效果后，再經6％脲變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染方法參照文獻的改進方法，最后進行照相。

2、結果與分析

2.1 基因組DNA提取及檢測

以Alamo幼苗進行的DNA提取方法的比較試驗結果(見圖1)表明：CTAB法提取的DNA量大，但存在嚴重的拖尾，可能是因為所提取的DNA分子量范圍比較大或者存在殘余的RNA。而Tiangen試劑盒法提取的DNA亮度較小，但電泳條帶很狹窄，說明所提取的DNA分子量范圍均一，試劑盒中存在RNase，可以將殘余的RNA降解掉。同時CTAB法需要1.5個工作日而Tian-gen法僅需要0.5個工作日，提高了工作效率。

2.2 EST-SSR標記在高羊茅上的通用性

通過對50對EST-SSR引物的篩選，發現有42對可以從11種高羊茅上得到有效擴增產物，占引物總數的84％。但不同引物擴增情況不同。從擴增片段大小上看，大部分在預期片段范圍內(表1)，個別位點上出現了比預期產物大的片段。同時擴增到的片段數目也不盡相同。擴增片段大小的不同則反映出內含子的插入與否或等位基因間SSR重復模體單元的差異。擴增片段數目的差異說明相應位點上的等位基因數目不同。

2.3 供試材料SSR擴增產物的多態性分析

有效擴增的42對EST-SSR引物的電泳譜帶多態性分析表明，42對引物中有12對(表1)在不同樣品間產生多態性分離，引物的多態性比率為28.6％。其它引物在不同樣品間獲得的譜帶類型一致，沒有分離。因此主要利用這12對核心引物進行品種鑒定。

供試的11份高羊茅材料的擴增結果見表2?？梢钥闯觯汗矙z測到86個等位基因，平均每個位點的等位基因數目是4.5個，變幅為3-12；從譜帶類型上看：S3和S44引物擴增的譜帶類型最少(2類)，多態性百分率最低，為18.2％，而S11引物擴增的譜帶類型最多(9種)，多態性百分率最高，為81.8％；共擴增到多態性譜帶65種，平均多態百分率為59.1％。

從品種鑒定的角度看，以引物S11為例，擴增到了9種多態性譜帶(圖2)，其中Amigo和Quest具有相同的譜帶，金王月和爆炸組合具有相同的譜帶，而其他品種在這個位點上譜帶不同。試驗中發現不同引物不同品種擴增的產物存在譜帶重合的情況，因此只用1個引物進行品種鑒定區分是很不合理的，必須結合其他引物進行綜合的判斷。品種間存在兩個以上的位點有區別才算作兩個不同的品種。試驗表明，利用SSR技術進行高羊茅品種鑒定是可行、有效的。

3、討論與結論

3.1 高羊茅種子昂貴，且國內高羊茅草坪生產用種主要靠從國外引進，隨著貿易量的逐年增多，加快檢疫速度迫在眉睫。Tiangen試劑盒法對比傳統的CTAB法提取的總DNA數量可能較少，但質量高，試劑盒中的RNase可以有效去除RNA，同時提取時間較短，可以降低降解的概率同時又大幅度提高工作效率(從18h減到6h)。有效縮短檢測周期才能滿足貿易性進口種子快速檢疫通關的需求，這對于建立快速室內品種鑒定技術是很有意義的。

3.2 與來源于基因組的SSR標記相比，EST－SSR標記來源于相對保守的轉錄區域，所以比基因組SSR標記具有更高的通用性。這與本試驗的結果是一致的。因此，雖然EST-SSR標記的開發僅限于EST序列數據庫早已存在的物種，但對于一個特定物種，若缺乏相關的序列資料，源于其他近緣種的EST-SSR標記將是有效和可用的標記資源，這將節約引物的開發成本，也為比較基因組學研究提供了一個新途徑。

3.3 本研究從篩選出的42對SSR引物中，選取擴增譜帶穩定性較好、多態性和分辨率較高的12對，利用它們的電泳圖譜組合構成了供試高羊茅材料特有的DNA指紋，將這些材料逐一區分開。試驗表明，SSR標記具有高分辨力特性及共顯性的遺傳方式，用于高羊茅鑒定是可行的。從構建高羊茅品種鑒定規程的角度看，本試驗所選取的位點數目以及涉及的品種還很有限，是否可以有效鑒別其他高羊茅品種還需進行深入研究。

參考文獻：

[1]馬嘯，張新全，周永紅，等，高羊茅的分子標記應用進展[J]，草業科學。2006，15(2)：1-8

[2]陳海梅，李林志，衛憲云。等，小麥EST-SSR標記的開發、染色體定位和遺傳作圖[J]，科學通報，2005，50(20)：2208-2216

[3]梁宏偉，王長忠，李忠，等，聚丙烯酰胺凝膠快速、高效銀染方法的建立[J]，遺傳，2008，30(10)：1379-1382