愈創(chuàng)木基型和紫丁香基型木素小分子的漆酶生物改性

裴繼誠 劉海棠 胡惠仁 石淑蘭 張?chǎng)舞?/p>

（天津科技大學(xué)天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457）

白水中的溶解和膠體物質(zhì)（dissolved and colloidal substances，DCS）的積累對(duì)紙機(jī)運(yùn)行和產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。DCS物質(zhì)主要來自木材的某些組分，如半纖維素、果膠物質(zhì)、親脂性抽出物（木材樹脂）、木聚糖、木素降解產(chǎn)物等及造紙?zhí)砑又鷦缤坎拣ず蟿堄嗝撃珓⑵讋⒅糁鸀V劑等［1-3］。WagbergL.等［4］對(duì)TMP的白水進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，DCS中60％為碳水化合物，30％為木素類物質(zhì)，10％為抽出物。

對(duì)DCS的控制方法主要有化學(xué)控制法、工藝控制法、生物控制法。生物控制法是20世紀(jì)90年代才發(fā)展起來的一種新的控制方法。

對(duì)于用漆酶處理造紙廢水中的木素類物質(zhì)的研究報(bào)道很多。漆酶處理木材剝皮廢水，可去除90％以上的鞣酸類、酚類化合物，86％的氯代酚，99％的氯代愈創(chuàng)木酚和80％的氯代香草醛，92％的氯代兒茶酚［5］。白腐菌處理含有高濃芳香類化合物廢水能顯著降低廢水顏色和COD含量［6］。Tram etes（Coriolus）versicolor處理漂白廢水可使E段廢水脫色60％；Pratima Bajpal［7］研究表明，降解后的木素小分子單獨(dú)用漆酶處理會(huì)重新聚合。

目前的研究都是用漆酶直接處理廢水，但因?yàn)閺U水中的成分多且復(fù)雜，很難確定漆酶對(duì)廢水中某種類型的木素的作用機(jī)理，因此研究廢水中特定木素的漆酶生物改性是必要的。

針葉木和闊葉木木素中都含有大量的愈創(chuàng)木基，針葉木中愈創(chuàng)木基丙烷含量80％～90％，闊葉木和草類原料中還含有大量的紫丁香基丙烷結(jié)構(gòu)單元［8］。

本實(shí)驗(yàn)選取松柏醇作為一種愈創(chuàng)木基型木素小分子模型物，紫丁香醇作為一種紫丁香基型木素小分子模型物，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、凝膠滲透色譜、紅外光譜和顆粒電荷測(cè)定儀（PCD）等測(cè)試手段，進(jìn)一步探討了漆酶對(duì)木素生物改性的機(jī)理，為漆酶在處理富含木素酚類、氯酚類廢水的應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

漆酶由諾維信公司提供，商品號(hào)NOVOZY ME 51003，酶活800U/mL；松柏醇、紫丁香醇，購于Sigma-Aldrich；1-甲基咪唑，購于Sigma公司；乙酸酐、丙酮，購于天津市化學(xué)試劑二廠；聚二烯丙基二甲基氯化銨（polydi methyl diallyl ammonium chloride），實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

4000MS型氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS），美國瓦里安公司生產(chǎn)；515型凝膠滲透色譜儀，Waters410示差檢測(cè)器，美國Waters公司；VECTOR 22傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克儀器公司生產(chǎn)；PCD-03顆粒電荷測(cè)定儀，德國Mütek公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 漆酶處理

用少量丙酮分別溶解松柏醇、紫丁香醇于燒杯中，加入pH值4.5的NH4Ac-HAc緩沖溶液，配成質(zhì)量濃度為0.48g/L的溶液，加入漆酶，酶用量16U/mL，通氧，45℃恒溫水浴中處理2h。

1.3.2 GC-MS測(cè)定

（1）衍生化處理

松柏醇、紫丁香醇、松柏醇漆酶處理樣及紫丁香醇漆酶處理樣，分別加入1-甲基咪唑2mL和乙酸酐20mL進(jìn)行乙酰化，然后用正己烷10、5、5mL連續(xù)萃取［9］，正己烷溶液進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，反應(yīng)后的溶液棄去。

（2）GC-MS分析條件

氣相條件：DB-1毛細(xì)管色譜柱（0.10μm×0.25mm×30m）；測(cè)試過程：起始溫度60℃，保持1min。升溫程序：10℃/min，升至320℃保持3min。進(jìn)樣口溫度320℃。采用高純氦氣作為載體，流量為1mL/min，分流比為5。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度280℃，離子阱溫度220℃。掃描方式：全掃描，掃描范圍：50～1000amu（原子質(zhì)量單位，1amu=1.66×10-27kg）。電離方式：EI（電子轟擊），電子轟擊電壓為69.9eV，離子源的溫度為150℃，質(zhì)譜增益為254，發(fā)射電壓1388V，質(zhì)譜檢索譜庫為NIST2002，檢索物質(zhì)的匹配度均在95％以上。

1.3.3 凝膠滲透色譜測(cè)定

（1）樣品處理

新配制松柏醇、紫丁香醇溶液，經(jīng)漆酶處理（條件同1.3.1），漆酶處理后的溶液有明顯沉淀，用0.45μm的微濾膜過濾沉淀并洗滌。所得沉淀產(chǎn)物風(fēng)干。風(fēng)干樣置于P2O5真空干燥器中，待質(zhì)量恒定后進(jìn)行測(cè)定。

（2）測(cè)試條件

色譜柱：Ultrastyragel 103A，柱溫40℃，流動(dòng)相四氫呋喃，流速1.0mL/min；聚苯乙烯為標(biāo)樣，相對(duì)分子質(zhì)量分別為28500、10100、3250和1320。

1.3.4 紅外光譜測(cè)試

將漆酶處理產(chǎn)生的沉淀進(jìn)行溴化鉀壓片，掃描范圍：370～4000cm-1，分辨率4cm-1，掃描16次，環(huán)境氣體為空氣。

1.3.5 陽離子需求量的測(cè)定

采用顆粒電荷測(cè)定儀（PCD）來測(cè)定松柏醇溶液（配制條件見1.3.1）、松柏醇漆酶處理液、紫丁香醇溶液（配制條件見1.3.1）、紫丁香醇漆酶處理液和緩沖液空白樣的陽離子需求量，樣品用去離子水稀釋100倍進(jìn)行測(cè)定。陽離子標(biāo)準(zhǔn)溶液為0.0001mol/L聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液。

陽離子需求量的計(jì)算公式如下：

式中，q為陽離子需求量，mmol/L；V1為消耗標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V2為樣品的體積，取樣10mL；C為標(biāo)準(zhǔn)滴定液的濃度，mmol/L，C=0.1mmol/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS測(cè)定

GC-MS技術(shù)可提供保留時(shí)間和質(zhì)核比的信息，乙酰化松柏醇對(duì)照樣的質(zhì)譜圖和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫對(duì)照?qǐng)D如圖1所示。

圖1 乙酰化松柏醇對(duì)照樣的質(zhì)譜圖與4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚乙酯標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫

從圖1可看出，保留時(shí)間15.88min出峰物質(zhì)的質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫的4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚乙酯相似度為731，圖1中乙酰化松柏醇對(duì)照樣特征離子峰m/z是222.1，標(biāo)準(zhǔn)譜庫4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚乙酯的特征離子峰m/z是222.0，依質(zhì)譜圖信息可推知，乙酰化的松柏醇對(duì)照樣出峰保留時(shí)間為15.88min。

乙酰化紫丁香醇對(duì)照樣的質(zhì)譜圖和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫對(duì)照?qǐng)D如圖2所示。

圖2 乙酰化紫丁香醇的質(zhì)譜圖與2，6-二甲氧基甲酯標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫

從圖2可看出，保留時(shí)間9.99min出峰物質(zhì)的質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫的2，6-二甲氧基甲酯相似度為735，乙酰化的紫丁香醇對(duì)照樣特征離子峰m/z是154.1，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫中2，6-二甲氧基甲酯的特征離子峰m/z是150.0，依質(zhì)譜圖信息可推知，乙酰化的紫丁香醇對(duì)照樣出峰保留時(shí)間為9.99min。

乙酰化松柏醇對(duì)照樣和松柏醇漆酶處理樣GCMS色譜總離子流色譜圖如圖3所示。

圖3 松柏醇和松柏醇漆酶處理樣GC-MS總離子流色譜圖

從圖3可以看出，松柏醇乙酰化后的樣品中4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚乙酯在15.88min出峰很明顯，松柏醇漆酶處理樣相應(yīng)的時(shí)間內(nèi)松柏醇峰消失，檢測(cè)不到松柏醇單體的存在，推測(cè)松柏醇參與了反應(yīng)。

乙酰化紫丁香醇對(duì)照樣和紫丁香醇漆酶處理樣GC-MS色譜總離子流色譜圖見圖4。

圖4 乙酰化紫丁香醇對(duì)照樣和紫丁香醇漆酶處理樣GC-MS總離子流色譜圖

從圖4可以看出，紫丁香醇乙酰化后的樣品中2，6-二甲氧基甲酯在9.99min出峰很明顯，而紫丁香醇漆酶處理樣在相應(yīng)的時(shí)間內(nèi)，紫丁香醇色譜峰消失，檢測(cè)不到紫丁香醇單體的存在，推測(cè)紫丁香醇參與了反應(yīng)。

2.2 凝膠滲透色譜分析

GC-MS分析漆酶處理后的松柏醇和紫丁香醇試樣，沒有檢測(cè)到松柏醇和紫丁香醇單體，卻發(fā)現(xiàn)反應(yīng)過程有沉淀析出，推測(cè)在漆酶處理過程中松柏醇和紫丁香醇發(fā)生了自由基縮合反應(yīng)，分子質(zhì)量增大。CarstenMai等人［10］研究表明，漆酶可以催化木素結(jié)構(gòu)中的酚羥基生成苯氧自由基（Phenoxy），苯氧自由基之間可以發(fā)生共價(jià)連接，從而使木素之間發(fā)生共聚。為此，采用凝膠滲透色譜對(duì)漆酶處理產(chǎn)物的分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

表1 松柏醇漆酶處理樣的分子質(zhì)量及多分散性

松柏醇單體相對(duì)分子質(zhì)量為180.2，從表1可看出，漆酶處理后Mn為1658，Mw為1886；紫丁香醇單體相對(duì)分子質(zhì)量為154.2，漆酶處理后Mn為698，Mw為745，說明松柏醇、紫丁香醇經(jīng)漆酶生物改性，分子之間發(fā)生了一定的聚合反應(yīng)；依多分散性可看出，產(chǎn)物接近單分散樣品，分子質(zhì)量分布較集中。

2.3 紅外光譜分析

松柏醇與松柏醇漆酶處理樣紅外光譜圖如圖5所示。

圖5 松柏醇及松柏醇漆酶處理樣的紅外光譜圖

從圖5可看出，松柏醇在3464和3246cm-1處有酚羥基和側(cè)鏈上的O—H伸縮振動(dòng)吸收峰，而松柏醇漆酶處理樣的2個(gè)O—H吸收峰卻不見了。松柏醇漆酶處理后2855和2939cm-1處的—CH2伸縮吸收峰消失，推測(cè)松柏醇的γ碳有可能與它連著的羥基一同參與反應(yīng)。松柏醇漆酶處理后1452cm-1處—CH3的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1035cm-1處的甲基C—O變形振動(dòng)減弱，推測(cè)有可能是甲基參與了反應(yīng)，使得松柏醇以某種方式連接。松柏醇漆酶處理后802cm-1處1，2，4-三取代苯環(huán)的伸縮振動(dòng)，686cm-1處RCCRH順式伸縮振動(dòng)峰都消失了，推測(cè)漆酶處理，苯環(huán)取代基可能有變，苯環(huán)側(cè)鏈參與了反應(yīng)。1602、1421、662、618cm-1處苯環(huán)特征吸收峰強(qiáng)度和峰面積的增大，表明產(chǎn)物分子苯環(huán)的增加。在1271cm-1處出現(xiàn)芳基醚伸縮振動(dòng)，推測(cè)松柏醇以某種醚鍵方式連接。

紫丁香醇與紫丁香醇漆酶處理樣的紅外光譜圖如圖6所示。

圖6 紫丁香醇及紫丁香醇漆酶處理樣的紅外光譜圖

從圖6可看出，紫丁香醇在3489和3456cm-1處有吸收峰，這是紫丁香醇苯環(huán)上的酚羥基伸縮振動(dòng)；非醚化的酚羥基在1367、1239、1214cm-1處也有吸收峰，紫丁香醇漆酶處理樣在3432cm-1處締合為1個(gè)寬峰，1357cm-1處吸收峰明顯減弱，1239和1214cm-1的吸收峰消失，這說明在紫丁香醇漆酶處理的過程中酚羥基發(fā)生了反應(yīng)。紫丁香醇在2961、1458cm-1處甲基的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)和反對(duì)稱彎曲振動(dòng)消失或是減弱，說明漆酶改性過程中甲基參與了反應(yīng)，1029cm-1處甲氧基C—O變形振動(dòng)減弱，相應(yīng)的1272cm-1處芳基醚吸收強(qiáng)度增大，推測(cè)甲氧基被脫除。769、726、706cm-1處1，2，3-三取代苯環(huán)吸收峰消失。1615、1510cm-1處單核芳烴的CC振動(dòng)以及853、825cm-1處苯環(huán)δ（C—H）面外吸收強(qiáng)度及峰面積顯著增大，可推測(cè)苯環(huán)以某種方式連接在一起生成芳基醚，使聚合產(chǎn)物苯環(huán)增多，分子質(zhì)量增大。

2.4 陽離子需求量測(cè)定

采用顆粒電荷測(cè)定儀來測(cè)定松柏醇、紫丁香醇漆酶處理樣的陽離子需求量，進(jìn)而可知溶液中的陰離子電荷量，所得結(jié)果見表2。

表2 松柏醇、松柏醇漆酶處理樣、紫丁香醇、紫丁香醇漆酶處理樣的陽離子需求量

從表2可看出，松柏醇經(jīng)漆酶處理后，陽離子需求量從1.93mmol/L降為0.94mmol/L，紫丁香醇經(jīng)漆酶處理陽離子需求量從1.52mmol/L降為0.90mmol/L，這其中緩沖液空白樣的陽離子需求量為0.81mmol/L。若扣除緩沖液空白樣的陽離子需求量，算出漆酶處理松柏醇陽離子需求量下降88.4％，紫丁香醇陽離子需求量下降87.4％，由此可知漆酶對(duì)松柏醇、紫丁香醇這兩類木素酚類物質(zhì)的去除效果明顯。

3 結(jié)論

3.1 松柏醇、紫丁香醇經(jīng)漆酶處理后，GC-MS檢測(cè)這兩種小分子相應(yīng)的峰消失，說明松柏醇、紫丁香醇參與反應(yīng)，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，小分子單體已不存在。

3.2 凝膠滲透色譜測(cè)定松柏醇、紫丁香醇經(jīng)漆酶處理后分子質(zhì)量變大，進(jìn)一步說明松柏醇、紫丁香醇漆酶處理過程中發(fā)生了反應(yīng)，產(chǎn)物聚合。

3.3 紅外圖譜的結(jié)構(gòu)分析得出，松柏醇雙鍵以及β碳、γ碳都有可能參與了反應(yīng)。松柏醇、紫丁香醇甲氧基伸縮振動(dòng)消失，芳基醚吸收增強(qiáng)，苯環(huán)特征吸收峰的強(qiáng)度及面積顯著增大，由此可推測(cè)松柏醇、紫丁香醇單體以某種方式連接在一起生成芳基醚，使聚合產(chǎn)物苯環(huán)增多。

3.4 松柏醇、紫丁香醇經(jīng)漆酶處理后溶液陽離子需求量分別下降了88.4％和87.4％，說明漆酶處理使小分子木素類物質(zhì)聚合而沉降，減少了廢水中的陰離子垃圾，很大程度地降低了陽離子需求量，這使漆酶處理含木素類廢水具有廣闊的前景。

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