5種海洋微藻多糖體外免疫調節活性的篩選

周妍，王凌，孫利芹，王長海

（煙臺大學海洋學院，山東 煙臺 264005）

5種海洋微藻多糖體外免疫調節活性的篩選

周妍，王凌，孫利芹，王長海

（煙臺大學海洋學院，山東 煙臺 264005）

目的：研究5種海洋微藻多糖對小鼠體外免疫細胞功能的影響，篩選出免疫調節活性強的微藻藻株。方法：考察5種海洋微藻多糖對小鼠脾臟淋巴細胞增殖，腹腔巨噬細胞RAW264.7增殖、吞噬中性紅、釋放NO能力的影響。結果：5種海洋微藻多糖對小鼠免疫細胞具有不同的刺激能力，其中，紫球藻多糖可極顯著增強吞噬細胞的吞噬功能，促進巨噬細胞合成NO，促進脾淋巴細胞及腹腔巨噬細胞的增殖。證明紫球藻多糖具有增強小鼠細胞免疫功能的作用。

微藻多糖；脾淋巴細胞；腹腔巨噬細胞；免疫調節；活性；

海洋微藻是海洋生態系統中最主要的初級生產者，也是海洋生物資源的重要組成部分。海洋微藻多糖是由多個相同或不同的單糖基通過糖苷鍵相連形成的高分子碳水化合物。作為一種廣泛存在于微藻體內的天然大分子物質，海洋微藻多糖除了具有傳統的工業價值外，近年來的研究表明它們還具有多種生物活性及藥用功能，如增強機體免疫活性、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗輻射等作用；大量研究表明海藻多糖是通過調節機體免疫系統功能發揮這些作用的。海藻多糖可以通過促進淋巴細胞增殖與分化、刺激巨噬細胞的吞噬功能、促進細胞因子和抗體的產生等途徑來實現對機體免疫系統功能的調節[1-3]。本文采用小鼠脾臟淋巴細胞增殖以及腹腔巨噬細胞RAW264.7增殖、吞噬中性紅、釋放NO的能力為活性篩選指標，研究了5種海洋微藻多糖的免疫調節活性，旨在比較它們免疫增強作用的差異，篩選出免疫調節活性強的微藻，為研制新型免疫增強劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

紫球藻 (Porphyridium creuntum)、鹽藻 (Dunaliella peircei)、等鞭金藻3011 (Isochrysis galbana 3011)、塔胞藻 (Pyramimonas sp.)、綠色巴甫藻 (Pavlova viridi)，原種均購于中國海洋大學海洋微藻種質庫，后由煙臺大學海洋生化研究所純化并保存；小鼠巨噬細胞樣細胞株RAW264.7 (ATCC TIB-71) 由上海細胞研究所提供；清潔級昆明種小鼠，雌雄不限，體重18 ～ 22 g，購自山東綠葉制藥有限公司（許可證號：SYXK（魯）20030020）。

刀豆蛋白 A (ConA)、脂多糖 （LPS）、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、噻唑藍 (MTT) 和十二烷基磺酸鈉(SDS) 均為Sigma公司生產；RPMI-1640培養基為Gibco公司生產；新生小牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司生產。Synergy HT型酶聯免疫檢測儀為美國Bio-TEK公司生產；TE2000U熒光倒置顯微鏡為上海精密儀器儀表有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 微藻的培養 5種海洋微藻的培養在自制15 L平板式光生物反應器中進行，在海水培養液中加入各種營養鹽，其加入量參見文獻[4]，取生長旺盛、顏色正常的微藻進行接種，接種量為培養液的20%。控制溫度為 (23 ± 1) ℃，通氣量為2.5 L/min，光強為50 μmol/m-2·s-1，連續光照，培養到穩定期離心收集藻泥。

1.2.2 紫球藻胞外多糖制備 將收集的紫球藻藻液離心，取上清液，經旋轉蒸發濃縮后，加入3倍體積的乙醇沉淀，過濾、透析、冷凍干燥得粗多糖PEP。

1.2.3 胞內多糖制備 將收集的藻液離心，獲得新鮮的藻泥；加入5倍體積的去離子水，置于冰箱 (-4 ℃)中冷凍，然后取出融化。如此反復3次提取水溶物；將凍融后的溶液超聲破碎，離心10 min，棄殘渣，取上清液；將上清液在水浴中加熱，濃縮至原體積的 1/3，加入體積分數為 3%的三氯乙酸沉淀蛋白，離心(12 000 r/min) 10 min，取上清液；加入5倍體積的乙醇溶液(體積分數為95%)，離心取沉淀洗滌、透析、冷凍干燥得白色粉末為粗多糖[5]。免疫測定前，精密稱取紫球藻多糖PEP、鹽藻多糖PDS、等鞭金藻多糖IGP、塔胞藻多糖PSP、綠色巴甫藻多糖PVD各4 mg，溶于20 mL的RPMI-1640培養基中，得濃度為200 μg/mL的微藻多糖溶液，用直徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌備用。使用時依次倍比稀釋可得濃度為 100，50，25，12.5 μg/mL 的溶液。

1.2.4 小鼠單核巨噬細胞 RAW264.7釋放 NO能力的檢測 取處于對數生長期的小鼠單核－巨噬細胞RAW264.7，胰酶消化收集細胞，用含10% 胎牛血清的培養液將其制備成巨噬細胞懸液，調整細胞濃度為1 × 106個/mL，于96孔板接種100 μL/孔，置37 °C，5% CO2培養24 h。加入用培養液稀釋的不同濃度的微藻多糖100 μL/孔，并以100 μL LPS（2 μg/mL）、培養液作陽性和空白對照。繼續培養48 h后，從每個孔取50 μL培養上清液到一個新的96孔板中，加入等量的Griess試劑，室溫反應10 min，半小時之內在520 ～ 550 nm之間 (540 nm) 測定吸光度。根據標準曲線計算NO的含量[6]。實驗重復三次。

1.2.5 RAW264.7吞噬中性紅實驗 制備細胞濃度為1 × 106個/mL的巨噬細胞懸液，加入96 孔板，100 μL/孔，如1.2.4加藥，培養22 h后，每孔加入0.1%中性紅生理鹽水液100 μL，繼續培養20 min，傾去上清，溫PBS洗3遍，每孔加入細胞溶解液（為體積胞分數50%的乙酸和體積分數50%的無水乙醇）0.2 mL，室溫下靜置2 ～ 3 h，待細胞溶解后，即在酶聯免疫檢測儀上測540 nm處的吸光度[7]。

1.2.6 RAW264.7增殖能力的測定 制備細胞濃度為 5×105個/mL的巨噬細胞懸液，于 96孔板接種100 μL/孔，如1.2.4加藥，培養24 h后，SRB法檢測[8,9]570 nm處吸光值。

1.2.7 脾淋巴細胞增殖實驗 無菌取脾，制備小鼠脾淋巴細胞懸液，調整細胞濃度為 (8 ～ 10) × 106個/mL，于96孔板接種100 μL/孔，再分別加入培養液（空白對照）、10 μg/mL ConA（陽性對照）及不同濃度的微藻多糖溶液各100 μL/孔，置37 °C，5% CO2培養48 h。培養結束前4 h，用MTT法[8-9]測定酶標儀在570 nm的吸光值。淋巴細胞增殖指數SI=供試樣品組吸光值/空白對照組吸光值。

1.2.8 數據處理 所有數據均以均值±標準差表示。t檢驗采用SPSS11.5統計軟件包完成，以P ＜ 0.05表示差異顯著；P ＜ 0.01表示差異極其顯著。

2 結果與討論

2.1 對小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO的影響

5種海洋微藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO的影響結果如表1所示。結果顯示，紫球藻多糖 (PEP)和塔胞藻多糖 (PSP) 均可顯著地促進小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO的能力，在12.5 ～ 200 μg/mL的濃度范圍內，與空白對照組相比有極顯著差異 (P ＜ 0.01)。隨濃度增大，其促進作用逐漸增強，至200 μg/mL時釋放NO的作用達到最大值。低濃度范圍內 (12.5 ～ 25 μg/mL) 鹽藻多糖 (PDS) 促NO釋放的作用與空白對照組相比，無顯著性差異 (P ＞ 0.05)，隨著濃度的升高，釋放NO的能力增強，至200 μg/mL時可極顯著地促進小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO，其活性呈一定的劑量的依賴性。12.5 ～ 100 μg/mL范圍內，等鞭金藻多糖 (IGP) 與空白對照組基本無促進NO釋放的能力 (P ＞ 0.05)，而高濃度200 μg/mL時表示出極顯著促進小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO的活性。而綠色巴甫藻多糖 (PVD) 促NO釋放的活性最大值出現在低劑量組12.5 μg/mL，濃度增大，各劑量組活性之間無顯著性差異 (P ＞ 0.05)。

表1 5種海洋微藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞產生NO的影響（x±s, n=9)Tab. 1 Effects of polysaccharides from five micro-algae on NO production（±s, n=9)

表1 5種海洋微藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞產生NO的影響（x±s, n=9)Tab. 1 Effects of polysaccharides from five micro-algae on NO production（±s, n=9)

注：與空白對照相比，*P＜0.05, **P＜0.01。下同。

組別Group 200 μg?mL-1 100 μg?mL-1 50 μg?mL-1 25 μg?mL-1 12.5 μg?mL-1 PEP 19.721 ± 1.109** 14.891 ± 2.168** 11.558 ± 1.134** 7.884 ± 0.918** 7.204 ± 0.667**NO/μmol?mL-1 PDS 16.932 ± 1.548** 6.932 ± 1.273* 5.912 ± 1.018* 4.211 ± 0.419 4.415 ± 1.388 IGP 12.102 ± 2.020** 5.027 ± 0.751 4.959 ± 0.928 4.823 ± 1.109 4.1436 ± 0.333 PSP 10.401 ± 0.976** 10.333 ± 2.175* 9.585 ± 0.673** 8.633 ± 1.424** 6.184 ± 0.601**PVD 7.272 ± 1.071** 8.156 ± 0.751** 9.109 ± 2.410* 9.381 ± 0.855** 12.510 ± 1.364**Control 3.598 ± 0.509 LPS 8.905 ± 0.385**

2.2 對小鼠巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響

5種海洋微藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的影響見表2。在12.5 ～ 100 μg/mL的濃度范圍內，隨濃度增大，紫球藻多糖 (PEP) 和等鞭金藻多糖 (IGP) 刺激小鼠巨噬細胞吞噬中性紅的能力不斷增強，至100 μg/mL達到最大值，濃度繼續增大，其活性反而下降。鹽藻多糖 (PDS) 和塔胞藻多糖 (PSP) 巨噬細胞的吞噬活性呈現同樣的趨勢，不同的是在50 μg/mL時活性即達到最大值。綠色巴甫藻多糖 (PVD) 在低濃度范圍 (12.5 ～ 50 μg/mL) 內可極顯著刺激小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅 (P ＜ 0.01)，而在高濃度范圍內 (100 ～ 200 μg/mL) 對其吞噬能力呈現顯著的抑制作用 (P ＜ 0.01)。

表2 5種海洋微藻多糖對小鼠巨噬細胞吞噬中性紅活性的影響（x± s, n=9)Tab. 2 Effects of polysaccharides from five micro-algae on neutral red uptake of mouse macrophage（± s, n=9)

表2 5種海洋微藻多糖對小鼠巨噬細胞吞噬中性紅活性的影響（x± s, n=9)Tab. 2 Effects of polysaccharides from five micro-algae on neutral red uptake of mouse macrophage（± s, n=9)

組別Group 200 μg?mL-1 100 μg?mL-1 50 μg?mL-1 25 μg?mL-1 12.5 μg?mL-1 PEP 0.949 ± 0.038** 1.580 ± 0.013** 1.454 ± 0.033** 1.258 ± 0.028** 1.036 ± 0.0464**OD540 PDS 0.857 ± 0.042* 1.196 ± 0.007** 1.275 ± 0.007** 1.205 ± 0.018** 1.016 ± 0.061**IGP 0.755 ± 0.023 1.172 ± 0.040** 1.196 ± 0.007** 0.964 ± 0.008** 0.894 ± 0.079 PSP 0.917 ± 0.085* 1.009 ± 0.012** 1.612 ± 0.012** 1.537 ± 0.011** 1.517 ± 0.008**PVD 0.623 ± 0.094** 0.693 ± 0.080** 1.297 ± 0.046** 1.638 ± 0.036** 1.329 ± 0.015**Control 0.756 ± 0.007 LPS 1.168 ± 0.0129**

2.3 對小鼠腹腔巨噬細胞增殖的影響

5種海洋微藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞增殖的影響結果如表3所示。100 μg/mL時，紫球藻多糖 (PEP)、塔胞藻多糖 (PSP) 和鹽藻多糖 (PDS) 的活性都達到最大值，均可極顯著地促進小鼠腹腔巨噬細增殖的能力(P ＜ 0.01)。等鞭金藻多糖 (IGP) 的促巨噬細胞增殖活性隨濃度增大呈現先增大后減小的趨勢，在50 μg/mL時達到最大值。綠色巴甫藻多糖 (PVD) 低濃度時對小鼠腹腔巨噬細胞的增殖無顯著刺激作用 (P ＞ 0.05)，在高濃度200 μg/mL時可極顯著地促進小鼠腹腔巨噬細胞的增殖 (P ＜ 0.01)。

表3 5種海洋微藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞增殖的影響（±s, n=9)Tab. 3 Effects of polysaccharides from five micro-algae on the proliferation of mouse peritoneal macrophage (±s, n=9).

表3 5種海洋微藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞增殖的影響（±s, n=9)Tab. 3 Effects of polysaccharides from five micro-algae on the proliferation of mouse peritoneal macrophage (±s, n=9).

OD570組別Group 200 μg?mL-1 100μg?mL-1 50μg?mL-1 25μg?mL-1 12.5 μg?mL-1 PEP 0.080 ± 0.003** 0.110 ± 0.001** 0.096 ± 0.006** 0.078 ± 0.002** 0.068 ± 0.004 PDS 0.066 ± 0.002 0.077 ± 0.002** 0.074 ± 0.005* 0.062 ± 0.004 0.061 ± 0.002 IGP 0.069 ± 0.004 0.089 ± 0.008** 0.120 ± 0.004** 0.093 ± 0.002** 0.094 ± 0.008**PSP 0.085 ± 0.003** 0.092 ± 0.007** 0.065 ± 0.002* 0.073 ± 0.004* 0.062 ± 0.001 PVD 0.090 ± 0.005** 0.070 ± 0.008 0.069 ± 0.003 0.062 ± 0.002 0.062 ± 0.000 Control 0.06 ± 0.002 LPS 0.072 ± 0.001**

2.4 對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

5種海洋微藻多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響見表4。紫球藻多糖 (PEP) 可極顯著地刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖 (P ＜ 0.01)，并呈一定的劑量的依賴性，隨著濃度的升高，其增殖作用不斷增強。在12.5 ～50 μg/mL的濃度范圍內，隨濃度增大，等鞭金藻多糖 (IGP) 和綠色巴甫藻多糖 (PVD) 刺激小鼠脾淋巴細胞增殖的能力不斷增強，至50 μg/mL達到最大值，濃度繼續增大，其活性反而下降。塔胞藻多糖 (PSP) 各個濃度組均可顯著或極顯著地促進小鼠脾淋巴細胞增殖作用，且在12.5 ～ 100 μg/mL的濃度范圍內，隨濃度增大，作用不斷增強，在 100 μg/mL達到最大值。鹽藻多糖 (PDS) 對脾淋巴細胞的增殖作用與其他 4種藻比，相對較低。

表4 五種海洋微藻多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響 (x±s, n=9)Tab. 4 Effects of polysaccharides from five micro-algae on the spleen lymphopoiesis of mouse (x±s, n=9)

2.5 五種海洋微藻多糖各個指標活性最大值的比較

分別以五種海洋微藻多糖四個指標的活性最大值作圖，由圖1 (a) 和 (b) 所示，紫球藻多糖 (PEP) 的活性相對都較高；鹽藻多糖 (PDS) 除促巨噬細胞釋放 NO活性較高外，其余三個指標相對于其它幾種藻活性較低；等鞭金藻多糖 (IGP) 除促巨噬細胞增殖的活性較強外，另外三個指標活性相對較低；塔胞藻多糖 (PSP)、綠色巴甫藻多糖 (PVD) 的活性位于五種微藻多糖的中間水平。不同微藻的多糖，對同一免疫指標的最佳反應濃度不同：在巨噬細胞促進NO的釋放試驗中，除綠色巴甫藻多糖 (PVD) 活性最大值出現在低濃度 (12.5 μg/mL) 組，其它多糖均在最高濃度組 (100 μg/mL) 時出現最大值；在巨噬細胞吞噬中性紅試驗中，紫球藻多糖 (PEP) 活性最大值出現在100 μg/mL，綠色巴甫藻多糖 (PVD) 出現在25 μg/mL，其余3種均出現在50 μg/mL；而在巨噬細胞增殖試驗中，綠色巴甫藻多糖 (PVD) 活性最大值出現在高濃度 (200 μg/mL) 組，等鞭金藻多糖 (IGP) 出現在50 μg/mL，其余3種均出現在100 μg/mL；在促淋巴細胞增殖試驗中，紫球藻多糖 (PEP) 活性最大值出現在200 μg/mL，塔胞藻多糖 (PSP) 出現在100 μg/mL，其余3種微藻多糖活性最大值均出現在50 μg/mL。

圖1 (a) 五種海藻多糖活性最大值的比較 (1)Fig.1 (a) Maximal value comparison of five polysaccharides from five micro-algae (1)

圖1 (b) 五種海藻多糖活性最大值的比較 (2)Fig.1 (b) Maximal value comparison of five polysaccharides from five micro-algae (2)

3 結 語

已發現的免疫活性多糖，激活巨噬細胞是其最重要的作用機制之一[10]。多糖對巨噬細胞的激活作用可通過多種途徑實現：促進巨噬細胞的增殖，提高其對腫瘤細胞或病原微生物的毒性；提高吞噬活性；增加NO和ROS產量；誘導或調節細胞因子和趨化因子的分泌等。脾臟是機體內重要的免疫器官，是體外試驗中淋巴細胞的重要來源。測定淋巴細胞體外增殖反應是檢測淋巴細胞功能的常用方法[11,12]。本研究中 5種海洋微藻多糖可不同程度地激活巨噬細胞或促進脾淋巴細胞增殖，從而達到提高機體免疫功能的目的，其中，紫球藻多糖活性最強。

從實驗結果中我們發現，不同的海洋微藻多糖對同一免疫指標的影響程度有較大差別（作用的強弱不同），或是通過對不同的免疫細胞活性進行調節從而增強機體的免疫功能（作用的靶細胞不同），例如，紫球藻能極顯著刺激淋巴細胞增殖反應，而鹽藻多糖則不能，這可能是其免疫增強作用的機制不同造成的，因此，還要結合其他的實驗才能給這些多糖的免疫增強作用做出準確的評價。

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Immunomodulation activities of polysaccharides in vitro from five micro-algae

ZHOU Yan, WANG Ling, SUN Li-qin, WANG Chang-hai

(Marine School of Yantai University, Yantai 264005, China)

To study the effects of polysaccharides from five micro-algae on immunocell functions of mice in vitro, and screen out bioactive marine micro-alga. The immune stimulating activities of polysaccharides from five micro-algae toward mice cells，including stimulating spleen lymphocyte proliferation and macrophage proliferation, enhancing phagocytic activity of neutral red, increasing nitro oxide (NO) production were tested. The results showed that the polysaccharides from these five micro-algae had stimulating activities on cells mediated immunity in mice. The Porphyridium creuntum polysaccharides had the effect of enhancing phagocytic activity of neutral red, increasing nitro oxide (NO) production, and stimulating spleen lymphocyte proliferation and macrophage proliferation. It proved that Porphyridium creuntum polysaccharides had the effect of enhancing the immunocompence of the cells in mice.

Polysaccharides from micro-algae; splenic lymphocyte; peritoneal macrophage; immunomodulation;activities

A

1001-6932(2010)02-0194-05

2009-04-01；

2009-08-05

山東省自然科學基金（Y2007D59）；煙臺大學大學生科技創新基金(080605)；煙臺市科技攻關項目（2009219）

周妍，女，(1985－)，山東東營人，碩士研究生，從事海洋活性物質方面研究

王長海，教授，博士生導師，電子郵箱：chwang2001@sina.com