左旋多巴甲酯對斜視性弱視貓模型的作用

李勇文，林 興，張士軍，黎 榮，蔣偉哲，黃仁彬

(廣西醫科大學藥理學教研室，廣西南寧 530021)

弱視是影響兒童視力的主要疾病之一，不及時治療可以導致終身視力低下，其形成與出生后早期的視環境不良或影響視覺發育的多種因素有關，其發病機制尚在探索中。90年代起，國內外學者［1］對藥物治療弱視進行了許多臨床性的研究，目前臨床上多采用左旋多巴治療，取得了一定效果。然而，左旋多巴存在副作用多、耐受性差、效果不穩定等缺點。本實驗組經過對左旋多巴進行結構得到左旋多巴甲酯(LDME)，克服了左旋多巴的缺點，具有易溶于水、吸收快、易進入血腦屏障的特點。為觀察LDME在相對單因素條件下對弱視眼的作用，我們以斜視性弱視貓模型作實驗對象，探討LDME對弱視發病機制的影響及對弱視的治療作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 眼電生理視覺誘發電位儀:德國羅蘭RETI-Roland;包埋機:日本SAKURA FINETECHNICAL CO LTD，4590型;病理組織切片機:德國Leitz，2235型;病理圖像分析儀:德國萊卡公司，DMR+550型;

1.2 主要試劑 c-fos原位雜交檢測試劑盒(泰普生物科學有限公司，批號:09090630);DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術公司，批號:DAB-0031);麻醉劑:烏拉坦20 g，加蒸餾水至100 ml;灌注液:NS;4℃ 40 g·L－1多聚甲醛;緩沖液:30 g·L－1檸檬酸，2 ×SSC，0.5 mol·L－1PBS;5 g·L－1多聚賴氨酸;DEPC:二乙基焦碳酸酯。

1.3 實驗動物模型建立及分組 初生家養幼貓(4～6 wk)30只，體重約300～350 g?！狻岵环?，常規檢查雙眼，確認外眼、屈光間質以及眼底無異常。隨機分為6組，每組5只，即正常組(NC)、模型組(MC)、陽性對照組(PC)、鹽酸左旋多巴甲酯低劑量組(LDMEL)、中劑量組(LDMEM)、高劑量組(LDMEH)。除正常對照組外，其余于4 wk時行眼外直肌切除術以造成人工斜視，飼養1 mon，經P-VEP確定形成弱視后，灌胃給與鹽酸左旋多巴甲酯20、40、80 mg·kg－1，陽性對照組給左旋多巴 80 mg·kg－1，NC及MC均給與等量生理鹽水，每天1次，連續30 d。動物飼養于符合醫學實驗動物環境設施要求的飼養環境中。

1.4 取材及腦片制作 取材前先將實驗動物于給藥后d 31，測定P-VEP實驗結束后，各組貓均放入暗室內飼養48 h，然后暴露于正常視覺環境下2 h。用20%烏拉坦麻醉，將插管經左心室插入主動脈并切開右心房形成出口，首先經插管快速灌注4℃生理鹽水400 ml，再灌注4%用DEPC處理過的多聚甲醛400 ml。開顱取腦，根據Snider貓立體定向圖譜，分離出對應的視皮層17區，垂直矢狀軸切取初級視皮層的腦組織，浸入多聚甲醛液中后固定6 h，經常規逐級脫水，二甲苯透明后，浸蠟包埋。切片厚6 μm。分別做Nissl染色和原位雜交組織化學染色。

1.5 腦片原位雜交組織化學染色程序 參照“c-fos原位雜交試劑盒使用說明”進行。

1.6 統計學處理 細胞胞質呈棕黃色者為陽性細胞。每張切片隨機選出不重疊的3個視野進行計算機顯微圖像分析，計算每個視野中的陽性細胞數，換算成陽性細胞的密度。各組間陽性細胞數比較及各組貓P-VEP結果比較采用SPSS 13.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 P-VEP檢查結果各組貓P-VEP情況 從Tab 1可知，N75、P100、左右眼振幅比值、N75-135各組間均有不同程度的差異。在P100組中，MC組潛時延長，與正常組比較差異有統計學意義;治療后各組與模型組比較，潛時均有不同程度縮短，以高劑量組最為明顯，差異有統計學意義(P<0.01)。對于左右眼振幅比值，正常組的比值是0.85，斜視組為0.49，兩者相比差異有統計學意義(P<0.01);經用藥物治療后左右眼振幅比值均有所恢復，弱視眼振幅升高，以高劑量組最為明顯，與正常對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，結果見Tab 1。

Tab 1 P-VEP of Each group(n=5)

2.2 Nissl染色光鏡觀察結果 Nissl染色中，視皮質神經元的尼氏小體呈深藍色，細胞核淡藍色。在40倍光鏡下，正常對照組結構容易辨認，能夠清楚的區分出視皮質4層結構:自外向內依次為分子層(Ⅰ)、外層(Ⅱ/Ⅲ)、顆粒層(Ⅳ)及內層(Ⅴ/Ⅵ )，神經元分布均勻，染色均一。以此作為原位雜交分層計數的基礎。

2.3 左旋多巴甲酯對斜視性弱視貓視皮質c-fos基因表達影響 正常對照組貓視皮層c-fos mRNA陽性細胞分布廣泛，表達活躍，雜交細胞在各層間的分布情況為:Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ層密度較高，Ⅳ層密度最低。與正常對照組相比較，模型對照組弱視貓視皮層cfos mRNA雜交細胞在各層均減少，差異有顯著性(P<0.01)。與模型對照組相比，治療組(包括PC、LDMEL、LDMEM、LDMEH)c-fos mRNA 雜交細胞在視皮質Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ層均有增加，除在Ⅳ外，其余各組差異有顯著性(P<0.05)，而其中以LDMEH組最為明顯(P<0.01)，見Tab 2。

Tab 2 Density of expression of positive staining neurons of c-fos mRNA in each of layers divisions of the striate cortex in normal and strabismic cats(cell·mm －2)

3 討論

切斷幼貓的外直肌，在術后4 wk后能觀察到手術眼內斜視22°～35°，P-VEP檢測 P100峰潛時，P100波幅值與對照眼比較，均有明顯的潛時延長和波幅下降(P<0.05)，說明斜視貓模型視路神經元生理特性己經發生改變，斜視性弱視貓模型建立成功。

PVEP是給與視覺刺激后，在枕骨所記錄到誘發的生物電信號，反映了視覺信號從視網膜傳導到視覺中樞的生物電活動，它主要反映視網膜、視路和視皮質的功能。弱視眼視皮質中樞對圖形運動感覺及邊界對比效應敏感的神經元存在異常［2～4］，所以弱視眼圖形VEP檢查可出現明顯的空間對比及時間特征方面的異常，與對側眼或正常眼相比，可出現潛伏期延長及振幅降低［5，6］。Cleland 等［7］通過微電極技術測得弱視貓視皮質17區神經元空間敏感度下降與P-VEP改變相符。所以，P-VEP可以作為衡量弱視視皮質功能狀態的間接依據，在弱視的診療中具有重要作用，而在基礎研究中主要用于探討弱視發生的機制及觀察藥物的作用［8］。本實驗中正常貓的波形規整，有明顯的波峰。MC組潛時延長，左右眼振幅比值降低，與正常組比較差異有顯著性;治療各組P100波幅值提升、P100峰潛時縮短，且與模型對照組比較差異有顯著性，說明治療藥物左旋多巴甲酯不僅可以改善斜視性弱視貓的視敏度和視覺傳導功能，斜視眼視功能有所恢復。其可能的機制:左旋多巴甲酯結構上與左旋多巴相似，其作用機制應該相似，左旋多巴是多巴胺的前體，多巴胺不能通過血腦屏障，而左旋多巴可穿過血腦屏障并轉化為多巴胺，發揮其藥理作用。故我們推測左旋多巴甲酯可能通過以下途徑發揮作用:其一，弱視的發生可能與眼局部及中樞神經系統多巴胺等神經遞質濃度相對不足，不能有效地傳導該眼視覺細胞的神經沖動，造成視通道傳導處于一種廢用性休眠狀態有關。通過給予脂溶性良好的LDME，LDME很容易進入腦內從而提高視覺通路DA的濃度，激活休眠狀態的錐細胞及其視通道的功能，改善了該眼視路信息傳導的狀態，從而延長或恢復了視覺發育敏感期。另外，DA參與敏感期視皮質的發育，DA及兒茶酚胺代謝可以解除弱視眼的皮質抑制，從而改善視功能。

視皮質c-fos基因能夠對突觸刺激產生快速、短暫的表達，參與細胞內的信息傳遞過程的調節，視皮質c-fos基因反映神經細胞興奮性的變化［9］。作為第一信使的外來刺激作用于胞膜上的受體，激活膜內的第二信使，后者與相應受體結合后產生興奮性突觸電位，引起神經元的興奮，從而激活c-fos基因的轉錄，轉錄生成的mRNA逸出胞核到達胞質，翻譯成Fos蛋白，并進一步與Jun蛋白結合形成異源二聚體－激活蛋白-1(AP-1)，該異聚體蛋白重新轉位至核內后，結合到靶基因的DNA調節區，作為一個轉錄調節因子進而控制晚期反應基因的表達，發揮信使作用，從而將細胞外的信息轉換成細胞的一種持續功能變化［10，11］。谷氨酸受體、鈣離子和cAMP的作用影響著該過程。出生后早期視覺環境通過影響神經元受刺激的水平來影響視皮質內cfos mRNA的表達。在視皮質內，c-fos mRNA的基礎水平均較低［12］，所以在暗環境下，免疫反應性不會有明顯的改變而恢復自然環境短暫的時間后，c-fos mRNA會出現快速急劇短暫的增加，其數量相當于基礎水平的4倍［13］。本試驗預先將實驗動物放入暗室內飼養48 h，然后暴露于正常視覺環境2 h，以誘導c-fos基因的快速轉錄。實驗中各治療組c-fos mRNA在斜視性弱視貓視皮質各層神經元的表達均增多，除在Ⅳ外，與模型組比較其余各組差異有顯著性(P<0.05)，說明給藥后視皮質各層神經元出現一定程度恢復，甚至高劑量組在Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ層與正常組比較，差異均無顯著性(P>0.01)。提示c-fos mRNA能夠反映視皮質細胞的功能狀態。陽性對照組用藥后，c-fos mRNA在斜視性弱視貓視皮質各層神經元的表達均增多，與左旋多巴甲酯低劑量組比較差異無統計學意義，但與左旋多巴甲酯中、高劑量組比較差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。說明這兩個劑量組貓視皮質各層神經元的表達或功能狀態恢復比陽性對照組好。據此，我們推測:左旋多巴甲酯改善視功能可能與其介導視皮質c-fos基因的表達調控有密切關系，至于通過何種途徑尚需進一步實驗探討。

［1］Gottlob I，Stangler-Zuschrott E.Effect of levodopa on contrast sensitivity and scotomas in human amblyoia［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1990，31(4):776－8.

［2］Levi D M，Manny R E.The pathophysiology of amblyopia:electrophysio logical studies［J］.Ann NYA Cad Sci，1983，388:243－ 63.

［3］鄧大明，龍時先，麥光煥，等.左旋多巴對弱視眼視誘發電位影響的研究［J］.眼科學報，1997，13:182－5.

［3］Deng D M，Long S X，Mai G H，et al.Effect of levodopa on visual evoked potential in amblyomia［J］.Eye Sci，1997，13:182－5.

［4］Mohan K，Dhankar V，Sharma A.Visual acuities after levodopa administration in amblyopia［J］.J Pediatr Ophthalmol Strabismus，2001，38:62－7.

［5］吳樂正，吳德正.臨床視覺電生理學［M］.北京:科學出版社，1999:362.

［5］Wu L Z，Wu D Z.Clinical visual electrophysiology［M］.Beijing:Science Publing House，1999:362.

［6］馬克明，徐寶玲，劉琳琳，等.圖形視覺誘發電位在兒童弱視診斷中的應用［J］.中國現代醫生，2007，45(13):4－5.

［6］Ma K M，Xu B L，Liu L L，et al.The evaluation on the picture visual evoked potentials in diagnosis of children with amblyopia［J］.China Mod Doct，2007，45(13):4－ 5.

［7］Cleland G B，Crew ther D P.Normality of spatial resolution of retinal ganglion cells in cats with strabismic amblyopia［J］.J Physiol，1982，326:235－49.

［8］楊崇清，馬麗卿.視覺誘發電位在弱視發病機制研究中的應用［J］.浙江醫學，1999，21(10):636－7.

［8］Yang C Q，Ma L Q.The application of visual evoked potential in the study of amblyopia pathogenesis［J］.Zhejiang Med，1999，21(10):636－7.

［9］Keyser S M.The induction of gene expression in mammalian cells by radiation［J］.Sem Cancer Biol，1993，4(2):119－28.

［10］Kaczmarek L，Chaudhuri A.Sensory regulation of immediate-early gene expression in mammalian visual cortex:implications for functional mapping and neuralp lasticity［J］.Brain Res Bev，1997，23(3):237－56.

［11］萬旭英，羅 明，賀 平，吳孟超.苦參堿和氧化苦參堿體外對人肝癌細胞的誘導分化作用［J］.中國藥理學通報，2009，25(7):977－9.

［11］Wan X Y，Luo M，He P，Wu M C.Effect of matrine and oxymatrine on induction of differentiation of human hepatoma carcinoma cell linein vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):977－ 9.

［12］Zhang F，Halleux P，Arckens L，et al.Distribution of immediate early gene zif-268，c-fos，c-jun and jun-D mRNAs in the adult cat with special references to brain region related to vision［J］.Neurosci Lett，1994，176(2):137－ 41.

［13］Rosen K M，Mcormack M A，Villa-Komaroff L，Mower G D.Brief visual experience induces immediately early gene expression in the cat visual cortex［J］.Proc Natal Acad Sci USA，1992，89(12):5437－41.