Snail增強乳腺癌細胞MCF-7中P-gp介導的多藥耐藥

劉傳亮，王 輝，陳偉娟，王曉杰，李洪利，趙修世，李文通

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在乳腺癌的綜合治療中，化療占有十分重要的地位，然而臨床上許多腫瘤患者在經歷了數次有效的化療后對化療藥物產生了多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)。在MDR的研究中發現，多藥耐藥的乳腺癌細胞株侵襲、轉移能力與親本細胞相比明顯增強，近來研究表明耐藥細胞在形態上發生了上皮－間質轉化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)樣改變［1］，說明MDR與EMT間存在聯系。在本實驗中，我們將Snail真核表達載體轉染乳腺癌細胞后，再對細胞用阿霉素進行誘導，以觀察乳腺癌細胞EMT發生對P-糖蛋白(P-glucoprotein，P-gp)介導的MDR的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 MMLV cDNA試劑盒、PCR試劑盒、限制性內切酶、SYBR Real-time PCR試劑盒及Pfu DNA聚合酶購自大連寶生物公司;T/A克隆試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司;真核表達載體pCDNA3.1(－)及LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑盒購自Invitrogen公司;RNA提取試劑TRIzol購自北京索萊寶科技有限公司;P-gp抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司;MTT購自Sigma;阿霉素(adriamycin，ADM)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司;RPMI 1640培養基和胎牛血清(FCS)購自 Gibco。

1.2 方法

1.2.1 構建pCDNA3.1-Snail真核表達載體 從乳腺癌組織(濰坊市人民醫院提供)中用TRIzol提取組織RNA，取2 μg逆轉錄成 cDNA，以此為模板用Pfu擴增 Snail基因(NM_005985.2)，上游引物:5′-CCACTATGCCGCGCTCTTT-3′;下 游 引 物:5′-TCAG CGGGGACATCCTGAGCA-3′;PCR產物末端加 A后連接至T載體，構建成載體pUCm-T-Snail。連接產物轉化大腸桿菌DH-5α后，進行藍白斑篩選，Not I、BamH I做雙酶切鑒定，陽性克隆測序鑒定，測序正確后采用Not I、BamH I進行雙酶切;酶切產物連接到pCDNA3構建成pCDNA-Snail真核表達載體，并酶切鑒定。

1.2.2 細胞系的建立 人乳腺癌MCF-7細胞培養在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，于37℃，5%CO2培養箱中持續培養。采用脂質體轉染法轉染載體，按說明書進行操作，G418進行快速篩選。采用阿霉素低濃度加量持續誘導法［2］誘導細胞，并分別命名為MCF-7/ADM100、MCF-7/snail-ADM100和 MCF-7/pCDNA-ADM100。

1.2.3 細胞毒性試驗 取生長期細胞，配成1×107·L－1細胞懸液，接種于96孔板。24 h后加入含有0.1、0.4、1.6、6.4、25.4 mg·L－1阿霉素的培養液，培養48～72 h，棄上清，加 MTT。培養4 h，加入DMSO，測550 nm OD值。存活率按實驗組與對照組吸收值之比×100%計算，取3次實驗的均值作圖求 IC50值［3］。

1.2.4 阿霉素外排實驗 取生長期細胞，制備細胞懸液并轉移到24孔板上;阿霉素誘導組加入含20 μmol·L－1阿霉素的培養基，對照組加入完全培養基培養，在37℃，5%CO2培養箱中孵育30 min后，用預冷的完全培養基沖洗，置于37℃，5%CO2培養箱中孵育1 h，用預冷的PBS沖洗，置于冰上;流式細胞儀(FACS Calibur)測定細胞488 nm的熒光強度。

1.2.5 細胞中P-gp的表達 收集生長期細胞，PBS洗兩遍，用4%多聚甲醛固定40 min，PBS洗3次;加P-gp一抗，37℃孵育40 min，PBS沖洗2次;加FITC標記的IgG，4℃避光反應30 min，PBS沖洗3次，加300 ml PBS，用流式細胞儀檢測。

1.2.6 Real-time PCR TRIzol法提取細胞中總RNA后，取2 μg使用MMLV逆轉錄酶逆轉成 cDNA;Real-time PCR反應使用SYBR Green I檢測，按說明書進行操作。PCR引物 (上海生工合成)序列如(Tab 1)所示。

Tab 1 The primer of Snail，MDR1 and β-actin

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，結果用ˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 pCDNA3.1-Snail真核表達載體的鑒定 通過RT-PCR可獲得特異性Snail基因片段，長約799 bp(Fig 1A)。載體pUCm-T-Snail進行酶切鑒定，陽性克隆約在900 bp處見插入的Snail基因片段(Fig 1B)。陽性克隆測序后在Blast上進行比對(Fig 2)。

2.2 細胞毒性試驗 MTT檢測結果顯示MCF-7/Snail-ADM100細胞耐藥性高于MCF-7/ADM100細胞(P<0.05，Tab 2)。而且在同等藥物濃度下，MCF-7/Snail-ADM100組細胞生存率高于其它各組(Fig 3)。

2.3 阿霉素外排實驗 MCF-7、MCF-7/ADM100，MCF-7/pCDNA-ADM100和MCF-7/Snail-ADM100 4組細胞外排1 h后細胞內的阿霉素的熒光強度分別為196.3±18.97、50.8±6.33、48.3±4.98和7.1±0.85。MCF-7/Snail-ADM100細胞中藥物濃度明顯降低(P<0.05，Fig 4)。

Fig 1 A:Electrophoresis of Snail PCR amplification products;B:Enzyme digestion map of pUCm-T-Snail vector

Fig 2 Results of pUCm-T-Snail sequencing(From 9 bp to 834 bp)

Tab 2IC50value of cells to doxorubicin(±s，n=3)

Tab 2IC50value of cells to doxorubicin(±s，n=3)

*P<0.05 vs IC50value of MCF-7;#P<0.05 vs IC50value of MCF-7/ADM100;▲P<0.05 vs IC50value of MCF-7/pCDNA-ADM100

IC50values/mg·L－1RR MCF-7 0.03±0.015 1 MCF-7/ADM100 0.96±0.132* 32.1 MCF-7/pCDNA-DM100 0.95±0.098* 31.7 MCF-7/Snail-ADM100 32.76 ±4.531*#▲109.2

2.4 細胞中P-gp的表達 流式細胞術的結果顯示，MCF-7、MCF-7/ADM100、MCF-7/pCDNA-ADM 100和MCF-7/Snail-ADM100 4組細胞上P-gp熒光強度分別為 5.7±0.48、78.3±8.33、77.5±7.97、91.6±9.42。與MCF-7/ADM100細胞相比MCF-7/Snail-ADM100細胞上P-gp熒光強度明顯升高(P<0.05)。

Fig 3 Survival rate of cell lines

Fig 4 The result of ADM efflux assy

2.5 MDR1，Snail在細胞中的表達 分別將MCF-7細胞中 MDR1，Snail的均作為 1，在 MCF-7/ADM100細胞中兩種mRNA水平分別為20.42±2.45、34.48±4.31，MCF-7/pCDNA-ADM100 細胞兩種mRNA水平分別為21.02±3.09、33.79±4.11，而在MCF-7/Snail-ADM100細胞中兩種mRNA水平分別為130.2±15.76和112.2±13.27，較之其它細胞明顯升高(P<0.05，Fig 5)。

3 討論

MDR是指腫瘤細胞對一種化療藥物產生耐藥性后，對結構和作用機制不同的抗腫瘤藥物產生耐藥性，與腫瘤化療效果降低緊密相關［4］;EMT是指上皮細胞失去極性，獲得間質細胞表型的現象。在EMT發生過程中，細胞骨架重塑，細胞遷移能力增強，可引起腫瘤細胞的浸潤和轉移［5］。在多數腫瘤的進展過程中，均可出現MDR與EMT現象。近年來研究發現高表達 P-gp的多藥耐藥腫瘤細胞表現出較強的侵襲和轉移能力［6］。采用阿霉素誘導MCF-7細胞在使細獲得MDR的同時，也使細胞發生EMT樣變化［1］，這說明腫瘤細胞MDR與EMT之間可能存在一定的內在聯系，但腫瘤細胞能否通過EMT產生MDR變化尚不清楚，國內外亦未見該方面相關報道。為能證明EMT的發生能導致和促進P-gp介導的MDR，我們進行了初步研究。

Massoumi等［7］研究表明，通過轉染 Snail表達載體可使細胞獲得EMT樣組織學特征，而體外應用siRNA技術抑制Snail表達則觀察到相反變化［8］，這表明Snail可以在一定程度上反映腫瘤細胞的侵襲能力，是上皮性腫瘤EMT過程中的一個重要調節因素。因此，本實驗將Snail真核表達載體pCDNA3.1-Snail轉染人乳腺癌MCF-7細胞;對轉染后的細胞采用阿霉素誘導。將誘導后的細胞進行細胞毒性實驗，結果顯示MCF-7/ADM100細胞和MCF-7/Snail-ADM100細胞的相對耐藥指數分別為32.1和109.2，MCF-7/Snail-ADM100細胞耐藥性明顯升高;阿霉素外排實驗顯示MCF-7/Snail-ADM100細胞中藥物濃度降至7.1，相對MCF-7/ADM100細胞明顯降低，說明藥物外排能力提高;兩次試驗結果與流式細胞術和Real-time PCR所顯示的P-gp表達增多和MDR1 mRNA表達增多的結果相一致。實驗結果表明Snail與P-gp的表達相關，因此，在腫瘤進展過程中兩者的發生并不是一個孤立事件，它們之間可能存在密切聯系。

Fig 5 The mRNA relative level of Snail and MDR1

Yan等［9］的研究表明通過激活PI3K/AKT信號轉導通路，可導致細胞發生EMT變化;也有研究表明PI3K/AKT信號轉導通路的激活能上調P-gp的表達，從而導致腫瘤發生MDR［10］。此外，在對信號傳導通路的研究中還發現，激活MAPK通路也能導致細胞 EMT的變化和耐藥的發生［11，12］。這說明EMT和MDR的發生過程可能存在多種共同的信號轉導通路，這些信號通路在兩者發生的機制中可能起到了某種作用。另外，低氧環境作為惡性腫瘤生長的必要環境和導致EMT的重要因素，同時也能上調 P-gp 的表達［13，14］。這進一步說明了 EMT 與MDR之間可能存在共同激活的機制。然而，EMT和MDR的發生機制復雜，兩者相互作用的機制尚需進一步的研究。

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