人工養殖鱘魚頭中硫酸軟骨素的提取工藝

戶業麗 ，蔡煥煥 ，程波 ，呂中 ，曾琨琨 ，藍澤橋

（1.武漢工程大學綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430073；2.湖北天峽鱘業有限公司，湖北 宜都 443300）

人工養殖鱘魚頭中硫酸軟骨素的提取工藝

戶業麗1，蔡煥煥1，程波1，呂中1，曾琨琨1，藍澤橋2

（1.武漢工程大學綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430073；2.湖北天峽鱘業有限公司，湖北 宜都 443300）

對人工養殖鱘魚頭中硫酸軟骨素采用稀堿法進行提取工藝的研究，以硫酸軟骨素產率為考察對象，對影響產率的因素進行了單因素試驗，并在此基礎上通過正交試驗，確定硫酸軟骨素提取的最佳工藝。試驗結果表明：提取硫酸軟骨素的最佳工藝條件為NaOH濃度：0.06 kg/L、固液比：1/5（g/mL）、浸提溫度：25℃、浸提時間：20 h。在此條件下硫酸軟骨素的提取率為48.9%，其蛋白質和脂肪含量分別為0.980%和0.130%。

硫酸軟骨素；鱘魚頭；提取工藝；正交試驗

硫酸軟骨素（Chondroitin sulfate，簡稱 Chs）在體內以蛋白聚糖聚集體的形式存在于軟骨、腱、韌帶和主動脈等組織中，是糖胺聚糖的一種[1]。作為一種天然的生物高分子化合物，硫酸軟骨素具有促進冠狀動脈循環、降血脂、抗病毒、抗凝血、抗腫瘤等生物活性[2-5]。此外，硫酸軟骨素在醫藥、保健食品、美容化妝品等領域應用前景廣泛[6-8]。

硫酸軟骨素廣泛分布于人和一些動物如豬、牛、羊和魚等組織中，是動物的軟骨、血管壁、皮膚等結締組織的重要組成成分之一[1]。

鱘魚是一種軟骨硬鱗魚[9]，除軟骨本身之外，鱘魚魚頭中富含軟骨。對人工養殖鱘魚的加工來說，鱘魚魚頭是一種下腳料，而從人工養殖鱘魚魚頭中提取硫酸軟骨素鮮見文獻報道，基于此，本文對人工養殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素的提取工藝進行研究，以期為鱘魚資源的開發和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

人工養殖鱘魚魚頭：由天峽鱘業有限公司提供。

1.1.2 試劑

鹽酸（AR）：信陽淮河化學試劑有限責任公司；氫氧化鈉（AR）：天津市科密歐化學試劑有限公司；牛血清白蛋白（進口分裝），考馬斯亮藍（進口分裝）。

1.1.3 儀器

LD4-2A型低速離心機：北京醫用離心機廠；eppendorf centrifuge 5417R型冷凍微量離心機；FD-1冷凍干燥機：北京博醫康技術公司；TU-1800紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；BRUKER EQUINAX55傅里葉紅外光譜儀。

1.2 方法

1.2.1 人工養殖鱘魚魚頭制備軟骨粉

取出冷凍的鱘魚魚頭，流水化凍后，取出軟骨，于70℃水浴中加熱，除去脂肪及肉，再切成小塊，50℃烘箱中干燥，粉碎得軟骨粉，備用。

1.2.2 人工養殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素的提取

于磁力攪拌提取瓶中，加入一定量軟骨粉，氫氧化鈉溶液，在一定的溫度下攪拌浸提，浸提完畢后以鹽酸調pH6～7，離心，取上清。在上清液中加入2.5倍95%乙醇，于4℃放置過夜，離心，棄上清，沉淀加適量95%乙醇清洗，離心，收集沉淀，冷凍干燥，得白至淺黃色疏松狀的固體，即硫酸軟骨素。

1.2.3 人工養殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素的定性分析

1.2.3.1 硫酸軟骨素中脂肪含量的測定

依據GB5009.6—85[10]，索氏抽提法測硫酸軟骨素中脂肪的含量。

1.2.3.2 硫酸軟骨素中蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍法[11]對硫酸軟骨素中蛋白質的含量進行測定。

蛋白質與考馬斯亮藍形成的復合物在595nm處有最大的光吸收，吸收強度與蛋白質濃度呈線性關系。將牛血清白蛋白配制成濃度（C，mg/L）分別為20、40、60、80、100 mg/L，與考馬斯亮藍溶液反應后，分別測其595 nm處的吸光度（A595）。然后，做C-A595圖，得蛋白質標準吸收曲線，見圖1，其線性回歸方程為y=0.0031-0.012x（R2=0.9917）。

由標準曲線計算在不同條件下提取的硫酸軟骨素中蛋白質的含量ε，見公式①

式中：ω為由標準曲線計算出的硫酸軟骨素中蛋白質的含量，（mg/L）；w為硫酸軟骨素的質量，g。

1.2.3.3 硫酸軟骨素的光譜分析

采用KBr壓片法對硫酸軟骨素進行紅外光譜測定，采用掃描法對硫酸軟骨素進行紫外光譜測定。

2 結果與討論

2.1 NaOH濃度對人工養殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素提取率的影響

按1.2.2操作,其它條件不變,改變NaOH濃度,考察NaOH濃度變化對硫酸軟骨素提取率的影響,結果見圖2。

由圖2可知，在NaOH濃度低時，隨NaOH濃度的增加，硫酸軟骨素的提取率也隨之增加；但NaOH濃度超過一定值后，再增加NaOH濃度，硫酸軟骨素的提取率迅速降低。硫酸軟骨素在蛋白聚糖聚集體中與蛋白之間以糖苷鍵相連，提取硫酸軟骨素時，必須破壞多糖鏈與蛋白質的共價結合才能達到提取硫酸軟骨素的目的，NaOH所起的作用就是一方面破壞糖苷鍵，另一方面降解蛋白質分子中的肽鍵，因此隨其濃度增加，糖苷鍵和肽鍵不斷地斷裂，釋放出硫酸軟骨素，即硫酸軟骨素的提取率增加；但濃度超過一定值后，再增加NaOH濃度，反應體系堿性增強，硫酸軟骨素分子中的糖苷鍵也會降解，造成硫酸軟骨素損失而使提取率降低，所以NaOH濃度應控制在0.06 kg/L左右。

2.2 軟骨粉質量/NaOH溶液體積比對人工養殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素提取率的影響

按1.2.2操作,其它條件不變,改變軟骨粉質量/NaOH溶液體積比（固液比）,考察固/液比變化對硫酸軟骨素提取率的影響,結果見圖3。

從圖3中可以看出，液/料比的增加，硫酸軟骨素的提取率也隨之增加，但固液比超過1/5（g/mL），提取率增加有限，而反應體系的容積加大，在醇沉工序中，大量消耗乙醇，所以，從經濟和清潔生產角度來說，固液/料比保持在1/5（g/mL）比較合適。

2.3 浸提溫度對硫酸軟骨素提取率的影響

按1.2.2操作,其它條件不變,改變浸提溫度,考察浸提溫度對硫酸軟骨素提取率的影響,結果見圖4。

由圖4所示，浸提溫度增加，在一定溫度范圍內可提高硫酸軟骨素的提取率，但溫度超過25℃后，隨溫度升高，硫酸軟骨素分子中的糖苷鍵會降解，不僅造成提取率降低，還會使產品顏色變黃，所以浸提溫度為25℃左右。

2.4 浸提時間對人工養殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素提取率的影響

按1.2.2操作,其它條件不變,改變浸提時間,考察浸提時間對硫酸軟骨素提取率的影響,結果見圖5。

由圖5可知，適當地延長浸提時間，可提高硫酸軟骨素的提取率，但浸提時間超過20 h后，再延長時間，硫酸軟骨素提取率增加不多，反而會使產品外觀變差，故浸提時間以20 h為宜。

2.5 正交試驗確定人工養殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素提取的最佳工藝條件

為確定最佳提取工藝，采用L9（34）正交試驗，以NaOH濃度、固/液比、浸提溫度、浸提時間為試驗因子（見表1），硫酸軟骨素的提取率為指標進行正交試驗，結果見表2。

表1 因素水平表Table1 The level of factors table

表2 正交試驗的結果分析Table2 Resultanlysisoforthogonalexperiment

從表2可知：1）極差越大說明該因子的水平波動時，該因子對試驗的結果影響就越大，因而按照極差的大小來決定因子的影響順序為：NaOH濃度>浸提溫度>浸提時間>固液比。2）最佳提取工藝的確定。k1，k2，k3反映了因子各水平對試驗的影響，最大的k值對應著最好的水平。因此，鱘魚魚頭中硫酸軟骨素提取的最佳工藝條件為：NaOH 濃度：0.06 kg/L、固液比：1/5（g/mL）、浸提溫度：25℃、浸提時間：20 h。在此條件下，硫酸軟骨素的提取率為：48.9%（相當鱘魚頭軟骨粉質量）。

2.6 人工養殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素的質量分析

2.6.1 硫酸軟骨素中蛋白質的含量

稱取硫酸軟骨素0.100 g,定容至25 mL水中，按1.2.3.2操作（每組取3個樣，每個樣品測3次），取平均，代入公式①，計算得硫酸軟骨素中蛋白質的含量為0.980%。

2.6.2 硫酸軟骨素中脂肪的含量

按1.2.3.1操作，采用索氏抽提法測硫酸軟骨素中粗脂肪的含量為0.130%。

2.6.3 硫酸軟骨素光譜分析

采用KBr壓片法，對硫酸軟骨素在400 cm-1～4000 cm-1進行掃描，得到硫酸軟骨素的紅外吸收光譜，見圖6。

在200 nm～400 nm進行掃描，得到硫酸軟骨素的紫外吸收光譜，見圖7。

由圖6可知：在3470 cm-1附近有一寬的強吸收峰，為糖環上羥基的伸縮振動所引起的，在2926 cm-1附近有糖分子中C-H伸縮振動的特征峰，在1658 cm-1附近有乙酰氨基的N-H伸縮振動，在1131 cm-1和1072cm-1附近有C-O伸縮振動，在1259cm-1和827cm-1附近有硫酸基團的振動，說明樣品中含有硫酸軟骨素所有乙酰氨基、羧基、硫酸基、和糖環等官能團。

由圖7可知：樣品在268 nm～280 nm之間無核酸和蛋白質的吸收峰，而在220 nm附近有糖的吸收，且峰型尖銳，說明硫酸軟骨素樣品中核酸和蛋白質雜質含量少。

3 結論

1）首次對人工養殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素的提取工藝進行了研究，用稀堿法提取得到了硫酸軟骨素,為人工養殖鱘魚資源的綜合利用提供了依據。

2）在單因素試驗的基礎上設計了正交試驗，正交試驗表明：各因子對鱘魚頭中硫酸軟骨素提取率的影響大小為：NaOH濃度>浸提溫度>浸提時間>料液比；鱘魚魚頭中硫酸軟骨素提取的最佳工藝條件為：NaOH濃度：0.06 kg/L、固液比：1/5（g/mL）、浸提溫度：25 ℃、浸提時間：20 h。在此條件下，硫酸軟骨素的提取率為：48.9%（相當鱘魚頭軟骨粉質量）。

3）對提取的硫酸軟骨素進行了蛋白質含量和的脂肪含量分析，結果表明硫酸軟骨素中蛋白質和脂肪的含量分別為0.980%和0.130%。

4）硫酸軟骨素的光譜分析表明，提取的硫酸軟骨素樣品中核酸和蛋白質雜質含量少。

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Study on Extraction Technology of Chondroitin Sulfate from the Head of Farmed Sturgeon

HU Ye-Li1,CAI Huan-Huan1,CHENG Bo1,LüZhong1,ZENG Kun-kun1,LAN Ze-qiao2
（1.Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education＆Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430073，Hubei,China;2.HuBei Tianxia Sturgeon Company，Yidu 443300，Hubei，China）

Extraction technology of chondroitin sulfate from the head of farmed sturgeon was studied by dilute alkali,extraction rate of chondroitin sulfate was as a study object,single factor experiment and orthogonal experiment was carried out.The results show that the optimal condition of extraction was 0.06 kg/L of concentration of NaOH,the ratio of cartilage powder and the volume of sodium hydroxide is 1/5（g/mL）,25℃of temperature,and 20 h of extraction time.The extraction rate of chondroitin sulfate was 48.9%under the said condition.The content of protein and fat of chondroitin sulfate was 0.980%and 0.130%respectively.

chondroitin sulfate；the head of sturgeon；extraction technology；orthogonal experiment

09年湖北省基礎化學示范中心資助

戶業麗（1963—），女（漢），副教授，碩士，主要從事生物活性物質的分離、純化及活性研究工作。

2009-07-05