氯沙坦抑制內質網特有凋亡途徑在糖尿病大鼠腎臟中的保護作用

曹延萍，王 建，李 航，劉青娟，段惠軍

血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)通過血流及非血流動力學因素，在糖尿病腎病發生發展過程中起重要作用，氯沙坦為血管緊張素Ⅱ受體1拮抗劑(angiotensinⅡreceptor 1 antagonosm，AT1RA)，通過阻斷 AngⅡ與其受體結合，具有腎臟保護作用，研究表明［1］氯沙坦可以通過影響凋亡相關基因bax和bcl-2表達而抑制腎臟細胞凋亡。本研究觀察了氯沙坦對糖尿病大鼠腎臟細胞增殖、凋亡以及內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)標志蛋白 GRP78及其特有的凋亡途徑Caspase-12表達的影響，探討這種保護作用是否部分通過抑制內質網應激特有凋亡途徑實現，以期對其保護腎臟機制得以更深一步的認識。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar♂大鼠由河北省實驗動物中心提供。鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，Sigma公司)，小鼠抗大鼠PCNA單克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)，兔抗GRP78單克隆抗體(NeoMarkers公司)，Caspase-12單克隆抗體(Abcam生物制品有限公司)，TUNEL試劑盒(Promega公司)，科素亞(杭州默沙東制藥有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型及分組 選取體質量120～140 g♂Wistar大鼠30只，所有大鼠均用戊巴比妥鈉(40 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，行右腎切除術。2周后大鼠切口完全愈合。隨機分為右腎切除對照組(A組n=10)、糖尿病組(B組n=10)和氯沙坦治療組(C組n=10)。B組和C組大鼠腹腔單次注射STZ(65 mg·kg－1WT，用 pH 4.5，0.1 mol·L－1枸櫞酸鈉緩沖液配制)，A組只注射相同體積的枸櫞酸鈉緩沖液。48～72 h后，血糖≥16.7 mmol·L－1，尿糖～確認為糖尿病模型。C組每天用氯沙坦按40 mg·kg－1灌胃56 d，A及B組只灌等量蒸餾水。實驗期間動物自由進飲食，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.2.2 標本收集 DM模型建成后，每周測血糖1次，不符合標準者棄去;于成模8周稱重后用代謝籠收集24 h尿，乙醚麻醉，股動脈取血，分離血清，用于生化指標測定。切取左腎，去掉被膜，濾紙吸干血跡后稱重，部分置于質量分數0.04多聚甲醛固定留做HE、PAS染色及免疫組化、TUNEL檢測，部分置于體積分數為70的乙醇固定后行流式細胞術檢測。

1.2.3 血、尿生化指標測定 Glu、Scr、Ucr、BUN、尿蛋白均用日立7170A全自動生化分析儀測定，并計算肌酐清除率(creatinine clearance，Ccr)。

1.2.4 常規病理學觀察 腎組織石蠟包埋后切片2 μm，常規HE、PAS染色，光鏡下觀察腎組織形態學改變。

1.2.5 免疫組織化學檢測 采用SP法。2 μm腎組織切片，常規脫蠟至水，一抗PCNA、GRP78(1∶100)，Caspase-12(1∶1000)稀釋，二抗為生物素化山羊抗兔IgG，PBS替代一抗作為陰性對照，DAB顯微鏡控制下顯色。

1.2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡 腎臟2 μm切片常規脫蠟入水，蛋白酶K室溫下消化，TDT酶反應液37℃孵育1 h，體積分數為0.3 H2O2抑制內源性過氧化物酶，Streptavidin-HRP室溫5 min，DAB顯色，蘇木精復染。陰性對照采用無酶標記液(刪除TDT)代替TDT酶反應液。凋亡細胞核呈棕褐色顆粒，光鏡下觀察并計數凋亡細胞。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡水平及GRP78和Caspase-12的表達 將標本用網搓法制成單細胞懸液，采用間接免疫熒光法，在細胞懸液中分別加入1∶200稀釋的兔抗 GRP78和1∶1000的兔抗Caspase-12單克隆抗體，37℃溫浴30 min后洗滌，加入羊抗兔FITC-IgG，溫浴洗滌后行流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司，Epics-XLⅡ型)檢測，測量的數據應用相應的程序進行資料處理，測定前以標準樣品調整儀器CV值在2%以內。GRP78和Cas pase-12表達的定量分析以熒光指數(FI)表示其相對含量:FI=(樣品的平均熒光強度－對照樣品平均熒光強度)/正常組織平均熒光強度。

2 結果

2.1 腎功能改變 8 wk時B組與A組相比，血糖、BUN和尿蛋白明顯增高，Ccr明顯降低(P＜0.05)，C組與B組相比，血糖、BUN和尿蛋白降低，Ccr升高(P ＜0.05)，見 Tab 1。

2.2 腎組織病理學檢查 光鏡下A組腎組織未見病理改變，B組大鼠腎小球細胞外基質略增生，腎小管上皮細胞腫脹，可見空泡變性，部分萎縮或擴張。C組與B組相比病變明顯減輕。

Tab 1 Serum glucose，BUN，Ccr and 24 h urinary protein excretion in group A，B and C(n=10)

2.3 免疫組織化學檢測 PCNA、GRP78及Caspase-12在腎臟定位表達:PCNA、GRP78、Caspase-12在正常對照組大鼠腎皮質均有表達，PCNA陽性細胞為細胞核呈棕黃色，在100倍視野中連續不重疊的計數100個腎小管的細胞總數和陽性細胞數及50個腎小球的陽性細胞數，以腎小管細胞的陽性率和單個腎小球切面的陽性細胞數作為比較指標。3組腎皮質小球、小管內均可見陽性細胞，差別無統計學意義。GRP78在A組弱表達，主要位于遠端小管和集合管上皮細胞胞質內;B組表達明顯增多增強，尤以近曲小管胞質最為明顯，部分腎小球內細胞胞質也呈強陽性表達。Caspase-12 A組有表達，主要位于腎小管上皮細胞胞質內，B組表達明顯增強，小管及小球內均可見陽性表達。C組GRP78、Caspase-12表達部位與B組大致相同，程度介于A組、B 組之間(見 Fig 1、2)。

Fig 1 Immunohistochemical staining of GRP78 protein in renal cortex at 8 week (×100)A:Control group;B:Diabetic group;C:Treatment group

Fig 2 Immunohistochemical staining of Caspase-12 protein in renal cortex at 8 week (×100)A:Control group;B:Diabetic group;C:Treatment group

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡程度及對GRP78和Caspase-12半定量分析結果 B組細胞凋亡率、GRP78及Caspase-12表達程度較A組明顯增高，C組細胞凋亡率、GRP78及Caspase-12表達較A組有所增高，但較B組明顯降低，見Tab 2。

Tab 2 The expression of GRP78，Caspase-12 protein and apoptosis by flow cytometry

2.5 TUNEL定位檢測腎臟凋亡細胞 A組腎小管偶見凋亡細胞，B組細胞凋亡數明顯增高，小球、小管內均有陽性表達，但主要位于小管上皮細胞，尤以皮髓質交界處多見，C組凋亡細胞較B組有所減少(Fig 3)。

Fig 3 The apoptotic cells in renal cortex at 8 week (TUNEL staining×100)A:Control group;B:Diabetic group;C:Treatment group

3 討論

腎素－血管緊張素系統(RAS)對血壓調節和水、電解質平衡起重要作用，血管緊張素肽Ⅱ(AngⅡ)是RAS的活性成分，在糖尿病腎病發生發展過程中發揮重要作用。除經典的調節血流動力學效應外，AngⅡ可導致ECM聚積和TGF-β表達明顯增加，刺激氧自由基及細胞因子的釋放，抑制一氧化氮(NO)合成［2］，除此之外還可以介導細胞凋亡。AT1RA氯沙坦可以阻斷Ang II與其受體結合，具有良好的腎臟保護作用［3－5］，本實驗糖尿病大鼠8 wk時，腎功能下降，凋亡細胞數明顯增加，腎小球和腎小管PCNA陽性細胞數差別無統計學意義，提示8 wk DM組大鼠腎臟細胞過度凋亡，氯沙坦治療組大鼠腎功能較糖尿病組明顯好轉，凋亡細胞數大大降低，證實了它的腎臟保護作用，并且這種作用部分通過抑制細胞凋亡實現。

ERS是近年發現的一條新的內在凋亡途徑，在糖尿病臟器損害過程中普遍存在。內質網(ER)對內環境的改變高度敏感，缺血缺氧、錯誤折疊蛋白的積聚、炎癥因子等都可干擾內質網正常生理功能，這種亞細胞器病理狀態稱為ERS。適度的ERS可以恢復ER及內環境穩態，保持細胞活性，但過強或過長時間的ERS將最終導致細胞凋亡。AngⅡ本身及其后續多種生物學效應均可作為應激源誘導ERS，檢測ERS標志蛋白GRP78及特有凋亡途徑Caspase-12的表達，分析DM大鼠腎組織局部ERS狀態，旨在更深入的探討AT1RA氯沙坦的腎臟保護作用的潛在機制。

78 000 u-糖調節蛋白(78 000 u glucose-regulated protein GRP78)屬于熱休克蛋白(HSP70)家族，是內質網分子伴侶蛋白，通過與內質網應激元件PKR、IRE1以及ATF6的結合抑制ERS的激活，在未折疊蛋白反應中發揮主要調控作用，GRP78的誘導廣泛被認為是ERS的標志性分子［6］。結果顯示，糖尿病組GRP78表達高于對照組，主要位于腎皮質近曲小管，部分腎小球也有表達。而氯沙坦治療組GRP78表達明顯下調，提示氯沙坦治療減弱了糖尿病大鼠腎組織局部ERS狀態。

Caspase-12定位于ER外膜，屬于Caspase亞家族成員，ERS時，細胞內Ca2+水平增高，引起胞質內鈣蛋白酶(calpain)活化并轉位ER膜，激活Caspase-12，活化的Caspase-12在無需細胞色素C參與的情況下可以進一步激活Caspase-9和Caspase-3引起凋亡，是獨立于膜受體或線粒體凋亡途徑的ERS特有凋亡途徑［7］。轉染了抗Caspase-12抗體的豬腎小管上皮細胞系LLC-PK細胞可以有效的抵抗順鉑誘導的凋亡［8］，是介導ERS凋亡的關鍵蛋白酶。DM組大鼠腎組織中Caspase-12表達較正常對照組明顯上調，氯沙坦治療組Caspase-12表達盡管沒有恢復到正常水平，但較DM組表達下降，并伴有腎組織凋亡細胞數明顯減少，提示氯沙坦的腎臟保護作用可能是部分是通過抑制過強的 ERS，進一步抑制Caspase-12的活化，減少細胞凋亡而發揮的。盡管這種作用機制尚未完全清楚，推測可能與下列因素有關:①AT1RA阻斷AngⅡ與其受體結合，改善腎血流狀態，緩解腎小球內高壓及缺氧，穩定內環境，有效逆轉ERS，從而減少凋亡發生。②AngⅡ可與胞膜受體結合，使受體依賴鈣離子通道開放，致細胞內鈣離子聚積［9］，可以刺激氧自由基及細胞因子的釋放［10］等，都可以作為應激源誘發 ERS，AT1RA 抑制其與受體結合，從根本上減少應激源的產生，減弱了ERS強度，抑制了ERS特有凋亡途徑，從而發揮了腎臟保護作用。

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