絞股藍有效成分殺滅釘螺效果和毒理研究

梁慧,耿鵬，倪紅，馬安寧，熊哲

(1. 武漢大學 基礎醫學院, 湖北 武漢 430070;2.湖北大學 生命科學學院，湖北 武漢 430062;3.湖北大學 資源環境學院，湖北 武漢 430062)

目前，殺滅釘螺(Oncomelaniahupensis)仍是控制血吸蟲病流行的重要手段[1].化學藥物是國內外使用較多的滅螺藥，如氯硝柳胺(Niclosamide)，五氯酚鈉(Na-pcp)等，但這些滅螺藥物對人畜、水生動植物有危害，其殘留物在環境中不易降解[2].從1933年至今已有1 000多種植物用于滅螺試驗，其中發現有20多種具有強烈的滅螺作用.而我們通過研究獲得的階段性成果證實：絞股藍﹑夾竹桃﹑天南星、羊蹄、楓楊﹑天名精等十幾種植物對釘螺具有很強的毒殺作用[3].絞股藍是一種經濟作物，在我國廣泛種植，本實驗通過提取絞股藍有效成分總皂甙與總黃酮類物質[4]，探討它們對釘螺的協同滅螺效果，并通過掃描電鏡和透射電鏡以及測定藥液對釘螺各部位膽堿酯酶(CHE)與乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響來探討其殺螺機理[5-7].為尋求到一種低毒、高效、價格低廉的滅螺藥物，提供一定實驗依據.

1 材料和方法

1.1材料絞股藍 (Gynostemmapentaphyllum) 購于湖北神農架；釘螺(Oncomelaniahupensis)采自荊州地區.

1.2主要儀器旋轉蒸發儀(型號: RE-52AA，上海亞榮)、傅立葉變換紅外光譜儀(規格型號：SPECTRUM ONE，技術指標: 檢測器 MIRTGS，掃描范圍:4 000～450 cm-1，分辨率:0.5～4.0 cm-1，紅外光源：MIR)；Hitachi H-600型掃描電鏡.

1.3 絞股藍有效成分的提取和初步鑒定

1.3.1 絞股藍有效成分Ⅰ和Ⅱ的提取 參見文獻[8-9]進行，略有改動.

1.3.2 上述有效成分的鑒定 將上述2種有效成分分別用傅立葉變換紅外光譜儀和化學試劑進行鑒定分析，再與標準物質圖譜對照，初步鑒定它們的結構.

1.4絞股藍水提物的制備將絞股藍全草洗凈風干，粉碎，按干重和水體積1∶10的比例，加入去氯清水，在室溫(約25 ℃)浸泡3 d 后，紗布過濾，濾渣再按上述處理2次，合并濾液，在水浴鍋中蒸發水分，并將剩余物在65 ℃ 烘箱中烘至恒重，得絞股藍水提物，將其磨成粉并過80目篩，待用.

1.5絞股藍有效成分滅螺實驗將絞股藍水提物粗粉、絞股藍有效成分Ⅰ和Ⅱ以及Ⅰ和Ⅱ等比例混合物分別用去氯清水配成濃度梯度為0.062 5、0.125、0.250、0.500、1.000 g/L 的溶液，采用WHO“殺螺劑實驗室終篩方法”中的浸泡法，進行浸殺釘螺實驗.同時以去氯清水飼養的釘螺作為對照.釘螺75只為1組(每一種處理為一組)，每15 只裝入一個尼龍網袋中，分別將各組(5袋/組)釘螺浸入盛有500 mL 的上述不同濃度溶液的玻璃缸中，每隔24 h 從各處理中隨機取出1袋釘螺，作存活檢查，統計死亡率.上述每一實驗重復3次，取其平均值作為實驗結果，實驗在25 ℃下進行.

1.6 殺螺毒理分析

1.6.1 電鏡樣品制備 分別取出在絞股藍混合液0.500 g/L 濃度下浸泡24 h 后的釘螺和去氯清水飼養的釘螺，分離取出其肝部、頭部、足部后放入2.5% 戊二醛溶液中固定，再分別用乙醇梯度脫水，乙腈置換，真空干燥，噴金，在Hitachi H-600 型掃描電鏡下觀察[10].

1.6.2 釘螺各部位膽堿酯酶(CHE)、乳酸脫氫酶(LDH)的酶活性測定 分別取出經絞股藍混合液不同濃度浸泡48 h后的釘螺與去氯清水飼養的釘螺，分離出釘螺肝部、頭部、足部，分別加預冷的0.2 mol/L pH 7.1磷酸緩沖液(0.1 mL /只)制樣，每樣30只釘螺，冰浴勻漿，4 ℃條件離心(12 000 r/min，10 min)，取上清液待測[7].用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測試.

2 結果與分析

2.1絞股藍有效成分的紅外光譜鑒定絞股藍有效成分Ⅰ和Ⅱ的紅外光圖譜(infrared absorption spectroscopy，IR)見圖1、2.

圖1 絞股藍有效成分Ⅰ的紅外圖譜

圖2 絞股藍有效成分Ⅱ的紅外圖譜

2.2絞股藍有效成分的滅螺效果將絞股藍水提物和絞股藍單一有效成分以及它們等比例混合物配成5種不同濃度的水溶液，分別浸殺釘螺，毒殺效果結果見表1.實驗表明：隨處理液濃度的增加和時間的延長，各種處理條件下的釘螺死亡率呈上升趨勢，殺螺效果依次為：絞股藍混合液>單一成分>水提物，有效成分Ⅰ和Ⅱ滅螺效果相當，混合液濃度為0.250 g/L，72 h就能達到93.33%殺螺效果.

2.3 殺螺毒理分析

2.3.1 SEM電鏡分析 用0.500 g/L 絞股藍混合液處理釘螺24 h 后分別取出肝部、頭部和足部，做掃描電鏡觀察，結果見圖3～8.從圖中可見，對照組釘螺肝臟外被的內臟囊表面呈網狀結構，隨肝臟實質組織一起形成溝回(圖3)，經處理后的釘螺肝臟表面節后受到破壞，溝回部分消失，肝臟部分溶蝕，出現網架結構(圖4)；對照組釘螺頭部(圖5)表面有成行的迂曲皺褶，皺褶上有密集的顆粒，呈球狀或橢圓形，經處理后的釘螺頭部皺褶被破壞，形成凹凸的嵴，呈索狀排列(圖6)；對照組足跖肌表面有清晰成行的褶皺，褶皺不迂回(圖7)，經處理后的釘螺足部褶皺出現缺失，且顯得雜亂(圖8).

圖3、5、7 分別為對照釘螺肝部、頭部和足部；圖4、6、8 分別為0.500 g/L 混合液處理釘螺24 h后的釘螺肝部、頭部和足部

表1 絞股藍水提物及各有效成分滅螺效果比較

2.3.2 CHE與LDH酶活性變化分析 經不同濃度絞股藍混合液浸泡釘螺48 h后，測得釘螺的肝部、全身和頭足部的CHE與LDH酶的活性變化，結果見圖9、圖10.

圖9 不同濃度混合液對釘螺各部位CHE酶活的影響

圖10 不同濃度混合液對釘螺各部位LDH酶活的影響

由圖9可知，隨著處理液濃度的升高，全身與肝部的CHE酶活性有一定升高，但隨著濃度的增加，酶活性逐步減弱.而頭足部則是在混合液濃度較大時，酶活力減弱較多，這表明，高濃度的絞股藍混合液對釘螺頭足部CHE影響較大，中毒相對于全身與肝部也較深.

由圖10可知，釘螺的頭足部、肝部和全身的LDH酶活力隨著混合液中濃度的增加變化不盡相同.在低濃度下，3 種酶活急劇下降后又迅速上升，隨后開始逐步下降，全身的LDH酶活隨著濃度的增加變化不大，而肝部的LDH酶活則隨著濃度的增加一直下降，而頭足部的LDH酶活則隨著濃度的增加而增加，這表明，高濃度的絞股藍混合液使釘螺肝部LDH酶活下降明顯.

3 討論

3.1絞股藍有效成分的滅螺效果據報道絞股藍整株水浸液[3]與絞股藍皂甙類物質具有很好的殺螺效果[11].本實驗以提取出的絞股藍總皂甙和總黃酮類物質為毒殺釘螺成分，比較了絞股藍單一有效成分和它們的混合成分水溶液滅螺效果，實驗表明，隨著藥液濃度的升高與時間的延長，其對釘螺的毒殺效果逐漸增強，在相同濃度條件下，絞股藍混合液滅螺效果優于單一組分，不同絞股藍有效成分有協同滅螺作用.但兩種有效成分的最佳配比以及與其它植物源滅螺成分的協同滅螺作用還有待進一步研究.

3.2 殺螺毒理分析

3.2.1 掃描電鏡表征 通過對釘螺的頭足部與肝臟的掃描電鏡觀察，絞股藍混合有效成分溶液對釘螺毒殺作用顯著，混合液浸殺后的釘螺頭部表面皺褶破壞，形成凹凸的嵴，褶皺消失，出現潰爛變形；釘螺足部的足跖肌及殼軸肌纖維被破壞，出現缺失，且顯得雜亂，可見有許多小孔洞，肝部部分溶蝕，迂回消失，看到網狀結構，說明絞股藍混合液對釘螺組織具有機械性破壞作用，且這種損傷作用隨浸泡時間的延長而逐漸加重，這與譚蘋報道的結果相一致[10，12].

3.2.2 CHE、LDH的測定酶活力 用酶促動力學法測定絞股藍混合液浸泡后的釘螺肝部、頭足部和整個軟體的膽堿酯酶(CHE)和乳酸脫氫酶(LDH)的酶活性發現，隨著藥液濃度的增加，釘螺頭足部CHE受抑制明顯，CHE是一類糖蛋白，存在于釘螺頭足部及神經干，檢測其變化在臨床上就有應用[13].CHE的降低標志著釘螺運動功能喪失，CHE是釘螺神經性質和功能的參考指標.LDH 是無氧呼吸過程中的重要酶[14]，實驗表明，在肝部LDH的酶活性受明顯抑制，LDH酶活性的下降說明絞股藍混合液影響釘螺糖酵解代謝，當混合藥液濃度比較低時，混合液刺激了釘螺頭部CHE和肝部LDH的合成，兩種酶活性均有升高，這表明釘螺表現出應激反應，用以增強釘螺的解毒能力；當混合藥液濃度比較高時，由于混合藥液作用強度超過了釘螺生理閾限及解毒能力，抑制了酶的活性，釘螺物質代謝和能量代謝出現紊亂，從而導致釘螺死亡，這與陳盛霞報道的相一致[15].

參考文獻：

[1] 王萬賢，楊毅，柯文山，等.楓楊水浸液滅螺實驗研究[J].應用生態學報，1999，10(4)：478-480.

[2] WHO Expert Committee on the Control of Schistosomiasis.The control of schistosomiasis: WHO technical expert series 830[M].Geneva: World Health Organization，1993: 58-64.

[3] 馬安寧，王萬賢，楊毅，等.滅螺植物資源的開發利用研究[J].自然資源學報，2000，15(1)：40-45.

[4] 侯金華，王萬賢，倪 紅，等.葫蘆科植物絞股藍(Gynostemmapentaphyllum)滅螺初步研究[J].湖北大學學報:自然科學版，2006，28(3)：306-308.

[5] 江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海：上?？萍汲霭嫔纾?979：88-590.

[6] 柯文山，王萬賢，楊毅，等.夾竹桃對釘螺肝損傷的超微結構觀察[J].電子顯微學報，2002，2(21)：1-2.

[7] 楊坤，周曉農，梁幼生，等.春季溫度變化對釘螺酶活性的影響[J].中國人獸共患病雜志，2004，20(6)：123-125.

[8] 郭文源，王萬賢.絞股藍栽培與產品開發[M].成都:電子科技大學出版社，1993：77-79.

[9] 方乍浦，曹憲儀.絞股藍中黃酮甙、有機酸的分離和鑒定[J].中國中藥雜質，1989，14(11)：36-38.

[10] 譚蘋，何昌浩，劉冰，等.檳榔堿與殺螺藥合用對釘螺頭足部影響的掃描電鏡觀察[J].中國血吸蟲病防治雜志，2001，l3(1)：21-23.

[11] 項秀麗，楊毅，王萬賢，等.絞股藍總皂甙滅螺活性研究[J].湖北大學學報:自然科學版，2008，30(1)：87-89.

[12] 譚蘋，楊建明，梁慧，等.空心蓮子草對釘螺組織影響的掃描電鏡觀察[J].電子顯微學報，2006，25 (3)：257-260.

[13] 潘琦.肝硬化患者血清白蛋白、膽堿酯酶及前白蛋白檢測意義[J].中國中醫現代遠程教育，2009，12(12)：298-298.

[14] 周靜.乳酸脫氫酶的分離純化及其性質的研究[J].赤峰學院學報:自然科學版，2009，25(9)：111-113.

[15] 陳盛霞，吳亮，楊小明，等.銀杏外種皮對釘螺的殺滅機理[J].動物學報，2007，53(1))：190-194.