龜皮膠原蛋白的提取及結(jié)構(gòu)表征(Ⅰ)

黃文,印大中,朱澤瑞

(1.湖南第一師范學(xué)院 數(shù)理系,湖南 長沙 410002;2.湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 湖南 長沙 410081)

膠原是生物體內(nèi)的一種纖維蛋白,主要存在于皮膚、骨、軟骨及肌腱等組織中,占人體或其他動(dòng)物體總蛋白含量的25%～33%[1].來源于動(dòng)物皮的膠原一般統(tǒng)稱為皮膠原,其主要組成為Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原,它們都屬于成纖維膠原.成纖維膠原因其化學(xué)組成、交聯(lián)和螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)而具有較強(qiáng)的機(jī)械性能、低免疫原性、較好的生物相容性和可生物降解性等生物學(xué)特性,因而廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、食品及材料等領(lǐng)域[2].人們對于豬皮或牛皮等哺乳動(dòng)物膠原的研究比較充分,而水產(chǎn)、兩棲、爬行等其他動(dòng)物皮中的膠原蛋白的研究和開發(fā)較少.隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展及中藥材龜板的取用,將會(huì)產(chǎn)生大量的龜皮,但對龜皮的研究非常有限.本研究就烏龜膠原蛋白的提取、膠原蛋白分子量測定以及氨基酸成分分析做了一些分析,為開發(fā)和利用龜皮膠原蛋白提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與儀器

1.1主要原料烏龜(湖南四進(jìn)生物開發(fā)股份有限公司提供),SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑,透析袋(14 000 ku),胃蛋白酶、Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白、高分子標(biāo)準(zhǔn)蛋白(均購自美國Sigma公司),氯化鈉,氫氧化鈉,丙酮,冰醋酸,鹽酸等試劑均為分析純.

1.2儀器和設(shè)備DYY-10型(ECP3000)三恒電泳儀,DYCZ-22A型垂直平板電泳槽,524型恒溫磁力攪拌器,LC-6A型日本島津高效液相色譜儀,凱氏定氮儀,D-37520 Osterode超速冷凍離心機(jī)(德國).

2 方法與步驟

2.1 膠原蛋白的提取

2.1.1 預(yù)處理 將烏龜處死去頭,鋸開兩邊的骨橋,剔除龜肉,取龜?shù)乃闹邦^部、尾部的皮膚,洗凈.將洗凈的龜皮切成5 mm×5 mm的小塊,丙酮脫脂10 h,風(fēng)干,貯存于4 ℃下備用.

2.1.2 膠原蛋白的酶解 本實(shí)驗(yàn)采用胃蛋白酶酶解法,胃蛋白酶可以在膠原鏈的非螺旋區(qū)的特定位點(diǎn)打斷膠原肽健,最大程度地保持了其天然結(jié)構(gòu),適合用作生物醫(yī)用材料.將預(yù)處理后的龜皮1 g,用雙蒸水洗滌3～4次,分別浸泡于 pH 2.5 的0.5 mol的冰醋酸中,靜置于4 ℃下24 h,待皮塊膨脹均勻后取出,加5 mL雙蒸水打漿.在漿液中加入1%的胃蛋白酶,于4 ℃下酶解24 h,每2 h攪拌10～20 min.

2.1.3 膠原蛋白的分離純化 將酶解液離心分離(8 000～10 000 r/min),取上清液以1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至7左右,靜置24 h.再次離心,棄上清液,以0.1 mol/L的醋酸溶液將沉淀溶解,溶液pH在2.5～3.在溶解液中加入固體NaCl,使溶液中鹽含量1.0 mol/L,靜置24 h,離心棄上清液,沉淀用0.1 mol/L醋酸溶液溶解,于0.05 mol/L醋酸溶液中透析2～3 d,(透析袋尺寸為14 000 ku),每5 h更換1次透析液,得純膠原溶液,置于4 ℃下保存?zhèn)溆?

2.2膠原蛋白分子量測定采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法,分離膠濃度為5%;積層膠濃度為3%;電極緩沖液為SDS-Tris-甘氨酸,電泳電流30 mA,電壓200 V,電泳時(shí)間為4～5 h.

2.3膠原蛋白的氨基酸成分分析稱取膠原蛋白樣品50 mg,加10 mL 6 mol/L HCl于(110±1) ℃水解24 h后過濾,取濾液0.5 mL抽干,加2 mL蒸餾水,混勻過濾,取濾液10 μL用鄰苯二甲醛衍生劑于室溫下衍生3 min,注樣測定.采用島津LC-6A 高效液相色譜儀進(jìn)行檢測.儀器工作條件:色譜分析柱為Waters的C18分析柱(150×4.6 mm);洗脫液A液為50 mmol醋酸鈉(pH 6.8,含17%甲醇,1%四氫呋喃),洗脫液B液為50 mmol醋酸鈉(pH 6.8,含77%甲醇,1%四氫呋喃);柱溫30 ℃;流量1.0 mL/min.熒光分析采用ex 338 nm/em 425 nm 檢測.采用凱氏定氮法測定膠原蛋白含量(換算因子為5.55).

3 結(jié)果與分析

3.1龜皮膠原蛋白的分子量測定結(jié)果蛋白質(zhì)分子量有多種測定方法,其中用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法(SDS-PAGE)經(jīng)濟(jì),且比較準(zhǔn)確,本實(shí)驗(yàn)主要檢測了龜皮膠原蛋白多肽產(chǎn)品分子量的分布.從Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白與龜皮膠原蛋白的電泳圖譜(圖1)可以看出,龜皮膠原蛋白由3條明顯的主帶構(gòu)成,保持了Ⅰ型膠原的基本結(jié)構(gòu),這表明龜皮膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白.但龜皮膠原蛋白的含量明顯比Ⅰ型膠原蛋白含量高(電泳圖譜顏色較深).Ⅰ型膠原占生物體膠原總量的90%左右,一般為透明、無分支的原膠原,是由3條α肽鏈組成.2條α鏈形成的肽鏈二聚體叫β-肽鏈,3條α鏈形成的肽鏈三聚體叫γ-肽鏈[3].肽鏈的螺旋區(qū)含有338個(gè)(Gly-X-Y)重復(fù)序列,X常為脯氨酸,Y常為羥脯氨酸或羥賴氨酸.α鏈中吡咯環(huán)的存在使N—C鍵不能自由旋轉(zhuǎn),構(gòu)成左手螺旋.3條α鏈依靠側(cè)鏈殘基相連,形成了原膠原(tropocollagen)分子特有的3股螺旋結(jié)構(gòu)[4].

經(jīng)48 h胃蛋白酶進(jìn)一步水解后(圖2),龜皮膠原蛋白的區(qū)帶數(shù)由3條分化成5條.原因可能是3條原有的結(jié)構(gòu)肽鏈被逐漸酶解形成小分子肽鏈,故原有結(jié)構(gòu)肽鏈的含量降低,帶型減弱,而新形成的兩條小分子肽鏈含量不斷增加,帶型極強(qiáng).根據(jù)電泳圖譜中分子相對遷移率區(qū)分為單股α1鏈、α2鏈,二聚體β1鏈、β2鏈和三聚體γ鏈.經(jīng)采用高分子標(biāo)準(zhǔn)蛋白測定,以相對遷移率(X=Rf)對相對分子質(zhì)量(Y=M)作圖(圖3),作擬合曲線,得到回歸方程Y=-85.958X+106.89,其線性回歸系數(shù)R2=0.996 3.

圖1 標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白與龜皮膠原蛋白的SDS電泳圖譜A標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白;B龜皮膠原蛋白

圖2 48 h酶解后龜皮膠原蛋白的SDS電泳圖譜(點(diǎn)樣量：從左至右分別為8、10、12 μL)

圖3 蛋白質(zhì)標(biāo)記相對遷移率(Rf)與相對分子量(M)的關(guān)系曲線

膠原蛋白組分γβ1β2α1α2Rf0.3000.4700.5090.7660.831M/ku80.62166.40563.11741.69036.276

由回歸方程和龜皮膠原蛋白各組分的相對遷移率,可以計(jì)算出各組分的相對分子量,結(jié)果見表1.由此推算出龜皮膠原蛋白的分子量約為288 ku.

3.2龜皮膠原蛋白與Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)蛋白的氨基酸成分分析將龜皮膠原蛋白和Ⅰ型膠原蛋白樣品進(jìn)行液相色譜分析,得結(jié)果如表2.

表2 龜皮膠原蛋白與Ⅰ型膠原蛋白的氨基酸成分分析 mg/100 mg

從表2的相關(guān)系數(shù)比較可以看出龜皮膠原蛋白與Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)蛋白的氨基酸成分呈高度正相關(guān),進(jìn)一步說明龜皮膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白.15種氨基酸含量比較發(fā)現(xiàn):龜皮中有甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、賴氨酸(Lys)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)5種氨基酸含量高于Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)蛋白,其余10種氨基酸含量低于Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

龜皮與Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)蛋白的氨基酸含量的方差分析表明(見表3):F>F14,15,0.01,即P<0.01,膠原蛋白中15種氨基酸之間的含量差異達(dá)到極顯著水平(F=33.74**,).由于龜皮膠原蛋白的含量高于Ⅰ型膠原蛋白,且與Ⅰ型膠原蛋白的氨基酸含量差異顯著,因此,龜皮膠原蛋白可以作為一種重要的皮膠原進(jìn)行開發(fā)和利用.

進(jìn)一步將龜皮膠原蛋白氨基酸含量進(jìn)行多重比較(表4)表明:15種氨基酸中甘氨酸的含量最高,與其它14種氨基酸的含量差異極顯著;其次是谷氨酸,它與精氨酸、丙氨酸差異不顯著,與天冬氨酸差異顯著,與其它氨基酸差異極顯著;再其次是精氨酸,它與丙氨酸、天冬氨酸和賴氨酸差異不顯著,與絲氨酸、蘇氨酸差異顯著,與其它氨基酸差異極顯著;而丙氨酸和天冬氨酸除了與酪氨酸、組氨酸和蛋氨酸差異顯著外,與賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨、亮氨酸、異亮氨、纈氨酸的差異不顯著.由此看來,膠原中15種氨基酸可歸納為四類:第Ⅰ類為高含量氨基酸1種,即甘氨酸(Gly);第Ⅱ類為次高含量氨基酸3種,即谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)和丙氨酸(Ala);第Ⅲ類為一般含量氨基酸9種,即天冬氨酸(Asp)、賴氨酸(Lys)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、纈氨酸(Val)、酪氨酸(Tyr);第Ⅳ類為微量氨基酸2種,即組氨酸(His)和蛋氨酸(Met).

表3 Ⅰ型與龜皮膠原蛋白氨基酸含量的方差分析

表4 龜皮膠原中15種氨基酸含量的多重比較

4 結(jié)論

(1)龜皮膠原蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果分析表明,龜皮膠原為Ⅰ型膠原蛋白.酶解后3條肽鏈分化成5條,表明龜皮膠原蛋白的3條肽鏈中僅有兩個(gè)斷點(diǎn),測得各肽鏈的分子量約為80.621 、66.405、63.117、41.690、36.276 ku,龜皮膠原蛋白的分子量約為288 ku.

(2)三種膠原蛋白的氨基酸含量比較表明:龜皮與Ⅰ型膠原的相關(guān)系數(shù)為0.997 1,這說明龜皮膠原蛋白極相似于Ⅰ型膠原蛋白.目前的研究工作已知:人類的Ⅰ型膠原是大直徑交叉條狀纖維的分子聚集體,α1鏈位于第17號染色體,遺傳編碼區(qū)長達(dá)4 392個(gè)核苷酸,編碼產(chǎn)物由1 464個(gè)氨基酸組成,含有51個(gè)外顯子;α2鏈位于7號染色體,遺傳編碼區(qū)長達(dá)4 098個(gè)核苷酸,編碼產(chǎn)物由1 366個(gè)氨基酸組成,含有52個(gè)外顯子[6].從進(jìn)化的角度看,Ⅰ型膠原屬比較原始的膠原,龜皮膠原與它相似,反映了烏龜物種的原始性.

(3)龜皮膠原中15種氨基酸比較發(fā)現(xiàn),龜皮中有甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸5種氨基酸含量高于Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)蛋白.丙氨酸作為糖異生途徑的前體物既可作為生物能量的物質(zhì)基礎(chǔ),又可以別構(gòu)抑制丙酮酸激酶的活性,給予生物合成前體過剩的信號.丙氨酸含量高,預(yù)示著烏龜肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性強(qiáng),可使烏龜體內(nèi)維持較高的氮水平,以達(dá)到高能儲(chǔ)蓄和低能消耗的目的.酪氨酸在一系列酶的作用下可轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴oA.乙酰CoA是生物代謝的能量載體,說明烏龜形成能量載體的原料充足,這對烏龜能量的儲(chǔ)存十分有利.

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