醬油曲霉發酵芝麻餅粕發酵基質的優化

邵元龍,董 英

江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013

醬油曲霉發酵芝麻餅粕發酵基質的優化

邵元龍,董 英＊

江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013

采用響應面法對醬油曲霉發酵芝麻餅粕提高抗氧化能力的發酵基質組成進行了優化。通過 Plackett-Burman設計法,評價了麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥麩、玉米漿、酵母膏和硫酸銨等 8個因素對 DPPH自由基清除能力的影響。篩選出麥麩、葡萄糖和硫酸銨為影響芝麻餅粕發酵提取物抗氧化活性的 3個顯著因素,然后用Box-Behnken試驗設計和響應面分析法,對 3個關鍵因素進行了探討與優化。優化的發酵條件為:葡萄糖、硫酸銨和麥麩添加量分別為:1.87%、1.54%和 2.55%。在該試驗條件下,DPPH自由基清除率為 80.26%,比未發酵的芝麻餅粕高37%。

芝麻餅粕;發酵;優化;抗氧化活性;醬油曲霉

國內外對芝麻餅粕中抗氧化物質的研究日趨深入,如對芝麻素的提取工藝、檢測方法[3-7]的研究。2003年,日本的Ohtsuki[8]等,用環狀芽孢桿菌 YUS-2液體發酵芝麻餅粕,發現兩種新的具有更強抗氧化能力的物質。2005年,日本的 Yoshiaki[9]等采用Aspergillus分別發酵芝麻素 (Sesamin)和三糖基芝麻素酚 (Sesaminol Triglucoside),轉化生成了具有兒茶酚結構的新物質,并顯示更強的抗氧化活性。2007年,董英[10]用醬油曲霉發酵芝麻餅粕,發現可以提高其抗氧化活性,但并未對發酵條件進行優化。因此,本文仍選用該菌株對芝麻餅粕進行發酵,以抗氧化活性為指標,對發酵培養基組分進行優化,為對發酵芝麻餅粕中抗氧化物質的提取,分析和轉化機制研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與儀器

菌株:醬油曲霉 (Aspergillus sojae),CICC2128:購自中國工業微生物菌種保藏中心;芝麻餅粕:江蘇鎮江京友調味品公司提供;二苯代苦味肼基自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH):美國 Sigma公司。

JJ-1型電動攪拌器:江蘇金壇醫療儀器廠;LD5-10離心機:北京醫用離心機廠;WFJ-72000可見分光光度計:尤尼柯 (上海)儀器有限公司;Y M50A電熱蒸汽壓力滅菌器:上海三申醫療器械有限公司; PSX智能型恒溫恒濕培養箱:寧波來福科技有限公司。

1.2 發酵方法

1.2.1 Plackett-Burman試驗設計

醬油曲霉接種于土豆汁 (PDA)斜面培養基上, 28℃培養 72 h后,加入 10 mL無菌生理鹽水,用接種針刮下,調節菌液濃度為 0.86×108cfu/mL。將粉碎的芝麻餅粕在烘箱中烘干,按料液比為 1∶3的比例加入正己烷,45℃水浴攪拌 3 h,4000 r/min離心 10 min,得脫脂芝麻餅粕。取 10 g烘干的脫脂芝麻餅粕加入9 mL溶解有不同成分的溶液,于 121℃滅菌 20 min,冷卻后,接種 1 mL制備好的種子懸液,搖勻,于 28℃條件下發酵 144 h。

根據 Aspergillus生長所需營養要素的基本原則和發酵影響因素的一般規律,結合相關的文獻報道和前期的實驗,選用試驗次數 N=12的試驗設計,對麥芽糖(A)、葡萄糖(B)、蔗糖 (D)、果糖 (E)、麥麩(G)、玉米漿(H)、酵母膏 (K)和硫酸銨 (L)8個因素進行考察,分別對應于表中的 8列,每個因素取兩個水平,響應值為提取液對DPPH自由基清除率(RSA%)。另設 3個虛擬列,以考察實驗誤差。對實驗結果進行分析,得出各因素的 F值和可信度水平。一般選擇可信度大于 90%以上的因素作為重要因素。實驗因素水平設計見表 1。

1.提高認識，統一思想，構建企業大黨建工作格局。非公企業黨組織是黨在企業中的戰斗堡壘，在企業職工群眾中發揮政治核心作用，在企業發展中發揮政治引領作用。明確“兩個作用”，引導社會各界認同和重視非公企業黨建工作，探索建立在黨委和組織部門領導下的各部門分工協作工作機制，構建企業大黨建工作格局。

表 1 Plackett-Burman試驗設計的因素水平Table 1 Levels of independent variable in Plackett-Burman design

1.2.2 Box-Behnken試驗設計

Plackett-Burman試驗方差分析表明,醬油曲霉固體發酵芝麻餅粕提取物的 RSA影響顯著的外界因子為葡萄糖 (P<0.05)、硫酸銨 (P<0.01)和麥麩(P<0.05)。試驗中響應值為DPPH自由基清除率(RSA%),試驗因素隨機編碼為:葡萄糖 (X1)、硫酸銨(X2)和麥麩(X3),試驗因素及水平設計如表2所示,發酵條件與 Plackett-Burman試驗一致。

表 2 Box-Behnken試驗因素及水平Table 2 Levels of independent variable in Box-Behnken design

1.3 提取方法

發酵結束后,每瓶加入 80%乙醇 75 mL,50℃水浴攪拌提取 2 h,轉速 150 r/min。上清液于 5000 r/min離心 10 min。沉淀按同樣條件重復提取一次,合并上清液,定容至 150 mL。

1.4 DPPH自由基清除率測定 (Radical Scavenging Activity,RSA)

取發酵提取液 1 mL,用 50%的乙醇稀釋 10倍,作為樣品液。DPPH溶液濃度為 7.5×10-6mol/mL,波長 517 nm,50%乙醇為對照。每個樣品重復測定兩次,求平均值。

計算公式為:

式中:A0—5 mL DPPH與 1 mL乙醇混合液的吸光度;Ai—5 mL DPPH與1 mL樣品反應后的吸光度;Aj—5 mL乙醇與 1 mL樣品混合液的吸光度[11]。

2 結果與討論

2.1 Plackett-Burman設計及結果分析

Plackett-Burman設計法是一種兩水平的試驗設計方法,它基于非完全平衡塊原理,可以用最少試驗次數估計出因素的主效應,適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素,供進一步研究用。對實驗結果進行分析,得出各因素的F值和可信度水平。一般選擇可信度大于 90%以上的因素作為重要因素[12]。Plackett-Bur man試驗 設計的實驗結果見表 3。

表 3 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 3 Design matrix and exper imental results of Plackett-Burman

由表 4各因素效應分析結果可知,經過菌株Aspergillus發酵后,葡萄糖、麥麩和硫酸銨三個因素對提取液清除 DPPH自由基影響顯著,可信度在90%以上,對此三因素進一步做響應面實驗。而其他因素的取值則根據各因素效應的正負和大小,正效應的因素均取較高值,負效應的因素均取較低值。

表 4 Plackett-Burman試驗設計結果相關系數和方差分析結果Table 4 Regression coefficients and variance analysis for the Plackett-Burman design result

2.2 Box-Behnken試驗設計及結果分析

Box-Behnken優化試驗設計和結果見表 5,利用Desig-Expert 7.0軟件,對表 5中數據回歸擬合,獲得Aspergillus發酵芝麻餅粕的提取物抗氧化能力對自變量葡萄糖、硫酸銨和麥麩的二次多項回歸方程:

表 5 Box-Behnken試驗設計及結果Table 5 Design matrix and experimental results ofBox-Behnken

-1 0 -1 7 0 . 2 6 6 1 0 -1 7 5 . 5 4 5 -1 0 1 7 2 . 4 6 8 1 0 1 7 9 . 6 4 7 -1 -1 6 9 . 8 5 1 0 0 1 -1 7 1 . 2 1 1 0 -1 1 7 5 . 1 4 1 2 0 1 1 7 7 . 7 5 1 3 0 0 0 7 8 . 7 9 1 4 0 0 0 7 8 . 2 6 1 5 0 0 0 7 7 . 8 8 9 0

模型方差分析見表 6,試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性 (P=0.0229),失擬項不顯著 (P=0.0569),其校正系數 R2=0.926,表明有約92.6%的抗氧化能力能由此模型進行解釋。所以自由基清除率與預測值之間具有較好的擬合優度,可用于 Aspergillus固體發酵提高抗氧化能力的分析和預測。表 6中,3個試驗因素中 X1和 X3對發酵提取物清除DPPH自由基能力的影響極顯著。硫酸銨和因素的交互作用影響皆不顯著。

表 6 Box-Behnken試驗結果方差分析Table 6 Analysis of variance for the Box-Behnken design result

2.3 模型驗證

表7 模型驗證Table 7 Model verification

?

為驗證Aspergillus固體發酵提高抗氧化能力模型方程的合適性和有效性,在葡萄糖、硫酸銨和麥麩試驗水平范圍內,選擇性地進行了 5組不同組合的實際驗證試驗 (表 7),同時設兩組未添加任何營養物質的芝麻餅粕作為對照。利用 SPSS(version 14.0)軟件對表 7中數據進行距離相關分析得知,自由基清除率實測值與預測值的相關系數 r為0.865,證明此模型是合適有效的,并具有一定的實踐指導意義。選擇 1號驗證試驗的因素組合作為優化的結果,即葡萄糖:X1=1.87%、硫酸銨:X2= 1.54%、麥麩:X3=2.55%,該條件下,芝麻餅粕發酵提取物清除 DPPH自由基活性為 80.26%,與未發酵的芝麻餅粕相比,活性提高 37%。

3 結論

3.1 用 Plackett-Burman試驗設計,篩選出影響芝麻餅粕發酵提取物抗氧化活性的關鍵因素由強到弱的順序為麥麩、葡萄糖和硫酸銨。在試驗因素水平范圍內,清除DPPH自由基能力隨含量的提高而增大。3.2 用 Box-Behnken試驗優化 Aspergillus固體發酵芝麻餅粕提高抗氧化能力的二次多項數學模型方程為:RSA%=78.31+2.22 X1+0.84 X2+2.27 X3-0.39 X1X2+0.48 X1X3+0.32 X2X3-1.77-2.76-2.06,且該方程的預測值與實際值相關系數 r為 0.865,符合程度高,具有一定的指導意義。根據方程優化的參數,獲得較優的發酵條件為:葡萄糖、硫酸銨和麥麩添加量分別為:1.87%、1.54%和 2.55%,在該條件下發酵,DPPH自由基清除率為 80.26%,比未添加營養物的芝麻餅粕高37%。

通過該優化試驗,為進一步對發酵餅粕中抗氧化物質提取工藝優化、組分分析,以及發酵機制的研究奠定了基礎。

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Optim ization the Substrate of Sesame Cake Fermentation byAspergillus

SHAO Yuan-long,DONG Ying＊
School of Food and B iological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China

Response surface methodology was used to optimize the substrate composition of improving the antioxidant activity in solid-state fermentation sesame cake byAspergillus sojae.The effects of maltose,glucose,sucrose,fructose, wheat bran,corn steep,yeast extract,and ammonium sulfate onDPPH radical scavening activitywere evaluated by Plackett-Burman design.The results showed that wheat bran,glucose,and ammonium sulfate were the main affecting factors and had significante effects on antioxidant activities.Then,the central composite design and response surface analysis were used to deter mine the optimal levels of the main factors.The optimized fer mentation conditions were as follows:amount of glucose,ammonium sulfate and wheat bran were 1.87%,1.54%,and 2.55%,respectively.Under this condition,the DPPH radical scavening abilitywas 80.26%,which is higher 37%than that of control.

sesame cake;fermentation;optimization;antioxidant activity;Aspergillus sojae

1001-6880(2010)06-1088-05

2008-12-15 接受日期:2009-04-09基金項目:江蘇省科技攻關項目(BE2005335)

＊通訊作者 E-mail:ydong@ujs.edu.cn

TS.201;Q939.97

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