東北紅豆杉 (Taxus cuspidata)中四種紫杉烷類化合物抑制婦科腫瘤細胞增殖活性研究及其作用機制的初步探討

李 珊,馬如飛,王思明,張嫚麗,王于方,董 玫＊,史清文,張紅真

1河北醫科大學第一附屬醫院婦產科,石家莊 050031;2河北醫科大學法醫學系河北省法醫學重點實驗室,石家莊 050017;3河北醫科大學藥學院,石家莊 050017

東北紅豆杉 (Taxus cuspidata)中四種紫杉烷類化合物抑制婦科腫瘤細胞增殖活性研究及其作用機制的初步探討

李 珊1,馬如飛2,王思明3,張嫚麗3,王于方3,董 玫2＊,史清文3,張紅真1

1河北醫科大學第一附屬醫院婦產科,石家莊 050031;2河北醫科大學法醫學系河北省法醫學重點實驗室,石家莊 050017;3河北醫科大學藥學院,石家莊 050017

通過四唑鹽(MTT)比色法檢測東北紅豆杉中四種紫杉烷類化合物對人子宮頸癌細胞、人子宮內膜癌細胞、人卵巢透明癌細胞和人卵巢囊腺癌細胞增殖的影響,不僅探討了這些化合物作用的構效關系,還初步探討了其抑制腫瘤細胞增殖的作用機制。結果發現 9,10-去乙酰紫杉寧對人子宮頸癌細胞、人子宮內膜癌細胞和人卵巢囊腺癌細胞的增殖均有明顯的抑制作用,與紫杉寧和 1β-羥基紫杉寧即使在 100μmol/L的高濃度下,對五種婦科腫瘤細胞的增殖不顯示抑制活性;流式細胞學檢查發現 9,10-去乙酰紫杉寧作用后的 HeLa細胞出現凋亡現象。因此推測:1.C-9,10位的羥基和 C-5位的肉桂酰基側鏈是該類化合物抑制腫瘤細胞增殖所必需的;2. 9,10-去乙酰紫杉寧有可能是通過誘導腫瘤細胞凋亡來實現其抑制 HeLa細胞的增殖作用。

東北紅豆杉;紫杉烷類化合物;腫瘤細胞;增殖活性;細胞凋亡

紅豆杉(俗稱紫杉,又稱赤柏松,yew)在植物分類學上歸屬于裸子植物亞門 (Gymnospermae),松杉綱 (Coniferopsidae),紅豆杉目 (Taxales),紅豆杉科(Taxaceae),紅豆杉族 (Taxeae)下的紅豆杉屬 (Taxus)。全世界約有 11種,主要分布于北半球,我國有4種 1變種,主要分布于甘肅、陜區[1,2],東北紅豆杉為其中的一種。民間用紅豆杉屬植物的果實和枝葉煎湯用以驅蟲、消積、潤燥、利尿消腫、通經,治療腎臟病、糖尿病、腎炎浮腫、小便不利、淋病、治療月經不調、產后瘀血、痛經等并且可以治療多種腸道寄生蟲[3-6]。

由于從紅豆杉科紅豆杉屬植物中發現了紫杉醇這一著名的抗腫瘤天然產物,紅豆杉屬植物成為近30年的研究熱點。隨著近年對紫杉醇及其前體物的需求量不斷攀升,尋找新的生物資源保護生態環境已迫在眉睫。盡管目前已經提取分離得到了大量的紫杉醇類似化合物,但迄今為止仍沒有紫杉醇的第二代藥物上市。本文對從東北紅豆杉 (Taxus cuspidata)的可再生資源部位小枝和針葉中分離純化得到的四種紫杉烷類化合物進行抑制 HeLa等人婦科腫瘤細胞增殖活性研究,并進一步探討其作用機制,為開發新的治療婦科腫瘤藥物提供理論依據。

1 材料、試劑與儀器

1.1 實驗材料

試驗用細胞株由日本千葉大學醫學部第二生物化學教室提供。HeLa:人子宮頸癌細胞株[7];HEC-1:人子宮內膜癌細胞株[8];SH IN3和 HOC-21:人卵巢透明癌細胞株[8];HAC-2:人卵巢囊腺癌細胞株[8]。試驗用正常細胞由河北醫科大學基礎醫學院細胞生物學實驗室提供。HELF:人胚肺成纖維細胞。紫杉烷類單體化合物 7-乙酰氧基-5-去桂皮酰基紫杉寧 (taxuspine F,1),紫杉寧 (taxinine,2),1β-羥基紫杉寧 (1β-hydroxyl-taxinine,3)和 9,10-去乙酰紫杉寧 (9,10-deacetyl taxinine,4)由河北醫科大學藥學院天然藥物化學教研室從東北紅豆杉的小枝和針葉中分離得到,經 1D-和 2D-NMR等波譜技術確定其結構如下(見圖 1)。

圖 1 四種紫杉烷類化合物化學結構Fig.1 Chemical structures of 4 non-paclitaxel-type taxoids

1.2 藥品和試劑

MTT為美國 Sigma產品,批號:Lot.T W 074,日本和光純藥工業株式會社;SDS為美國 Biotec公司產品;胎牛血清為 G IBCO公司產品;RPM I 1640和胰蛋白酶為 G IBCO公司產品;AnnexinⅤFITC KIT為晶美生物工程有限公司產品;Taxol由河北醫科大學藥學院天然藥物化學教研室提供。

1.3 儀器

生物顯微鏡:OLY MPUS,型號 JAPAN NO: 11058;CO2培養箱:MLO-18 A IL型,三洋電氣公司產品;倒置相差顯微鏡:LH50A型,日本 OLY MPUS產品;超凈工作臺:BHL-1300-2 B型,Airtech Japan;精密電子天平 (分度值 0.01 mg):L IBROR AEL-40 S M No.04001003,SH IMADZU CORPORAT ION;80-2低速離心機:江蘇富化儀器有限公司;YXQG 02式蒸汽消毒鍋:山東新華醫療器械有限公司;DHX-9243B型(101-3 B)電熱恒溫鼓風干燥箱:上海福瑪實驗設備有限公司;酶標儀:S/N:E 11325型為美國Precision microplate reader公司產品;光學顯微鏡:日本OLY MPUS生產;培養板:美國 Costar公司產品;流式細胞儀:FACSCalibur型為美國 Becton Dickinson公司產品。

2 實驗方法

2.1 腫瘤細胞株懸液制備[9]

用 RPM I1640完全培養液將被試腫瘤細胞株調整濃度為 2×105個細胞/mL的細胞懸液備用。

2.2 實驗用化合物的體外抑瘤實驗[10]

將被試腫瘤細胞株懸液接種于 96孔培養板,每孔 50μL(含 1×104個細胞),分別加入空白對照磷酸鹽緩沖液、溶劑對照(終濃度 0.5%DMSO)、陽性對照紫杉醇以及終濃度為1μmol/L、10μmol/L、100 μmol/L的化合物 1～4各 50μL,每組均設 3個復孔。置于飽和濕度、37℃和 5%CO2培養箱中培養48 h,于培養結束前 4 h,各培養孔加入 5 mg/mL四甲基偶氮唑藍 (MTT)10μL。培養結束后,棄去培養上清,每孔加入反應停止液 150μL,振蕩 10 min,使結晶充分溶解,用酶聯免疫檢測儀檢測各孔吸光度(OD)值,測定波長λ=570 nm,參考波長λ= 630 nm,并計算腫瘤細胞生存率。

腫瘤細胞生存率 (CS)%=實驗組OD值/對照組OD值×100%

2.3 流式細胞儀及AnnexinⅤ-FITC試劑盒分析細胞凋亡

按左連富等[11]方法。HeLa細胞傳代進入對數生長期,隨機分組,實驗組加入 50μmol/L的 9,10-去乙酰紫杉寧,空白對照組加入磷酸鹽緩沖液,于培養 48 h后收集細胞,用 4℃預冷的 PBS洗細胞兩次,用 250μL結合緩沖液重新懸浮細胞,調整其濃度為 1×106/mL,取 100μL的細胞懸液于 5 mL流式管中,加入 5μL AnnexinⅤ/FITC和 10μL 20 μg/mL的 PI溶液,混勻后于室溫避光孵育 15 min,在反應管中加 400μL稀釋好的結合緩沖液,及時上流式細胞儀分析。每次實驗重復 3次。

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 化合物 1～4對體外培養的 HeLa細胞增殖的抑制作用

結果如圖 2所示,陽性對照紫杉醇顯示強的抑制人子宮頸癌細胞 (HeLa)增殖活性的作用,用 1 μmol/L、10μmol/L和 100μmol/L的紫杉醇處理HeLa細胞,其腫瘤細胞生存率分別為 28.34%、22.82%和 15.23%;而 7-乙酰氧基-5-去桂皮酰基紫杉寧 (1)即使用 100μmol/L處理 HeLa細胞,其腫瘤細胞生存率仍為 100%,對 HeLa細胞的增殖不顯示任何抑制活性;當用 100μmol/L的與化合物 1母核結構相同,在 5位碳原子上連接脂溶性的肉桂酰基側鏈的化合物2、3和4處理HeLa細胞,其腫瘤細胞生存率分別為下降為 65.48%,51.27%和26.93%,并且與空白對照組相比較具有非常顯著性差異。通過腫瘤細胞生存率和化合物 4濃度的對數回歸方程 y=-12.595 Ln(x)+87.333,得到化合物 4對 HeLa細胞增殖的半數抑制濃度 (IC50)僅為19.38μmol/L。

3.2 化合物 1～4對其它四種婦科腫瘤細胞增殖抑制活性的影響

試驗結果如表 1所示。陽性對照紫杉醇對人子宮內膜癌細胞 (HEC-1),人卵巢透明癌細胞株(SH IN3和 HOC-21)和人卵巢囊腺癌細胞株 (HAC-2)的增殖不顯示任何抑制活性,I C50都大于 100 μmol/L。化合物 3僅對 HAC-2的增殖有較弱的抑制活性,其 I C50為 88.75μmol/L;化合物 4對 HEC-1和 HAC-2的增殖有較強的抑制活性,其 IC50分別為32.04μmol/L和 67.22μmol/L。化合物 1和 2對四種婦科腫瘤細胞的增殖均不顯示抑制活性,其I C50都大于 100μmol/L。

3.3 化合物 1～4對人胚肺成纖維細胞增殖抑制活性的影響

實驗結果如圖 3所示,陽性對照紫杉醇對人胚肺成纖維細胞 (HELF)的增殖呈現較強的抑制活性,IC50為 8.77μmol/L,化合物 1僅在 100μmol/L劑量組顯示較低的細胞增殖抑制活性,其細胞增殖生存率為 70.43%,C-5位具有肉桂酰基的其它三種試驗用化合物 2～4對 HELF細胞的增殖不顯示抑制活性,三種被試化合物的 IC50均大于 100μmol/L。

圖 2 四種紫杉烷類化合物對人宮頸癌細胞增殖的影響Fig.2 The effect of four non-paclitaxel-type taxoids on the proliferation of HeLa tumor cell line

表 1 四種紫杉烷類化合物對四種婦科腫瘤細胞增殖活性的影響Table 1 The effect of three sesquiterpene lactones on the proliferation of other tumor cell line

圖 3 四種紫杉烷類化合物對人胚肺成纖維細胞增殖的影響Fig.3 The effect of four non-paclitaxel-type taxoids on the proliferation of Human embryonic lung fibroblast

3.4 AnnexinⅤ-FIFC/PI雙染流式細胞術檢測結果

9,10-去乙酰紫杉寧 (4)以 50μmol/L處理 He-La細胞,于 48 h后進行Annexin-Ⅴ/PI染色,流式細胞儀檢測,結果顯示 HeLa細胞早期凋亡率為(48.51±6.84)%,PBS組為 (3.47±3.82)%,9, 10-去乙酰紫杉寧 50μmol/L濃度組與 PBS組相比,具有顯著性差異 (P<0.05)。流式細胞檢測提示9,10-去乙酰紫杉寧具有明顯誘導 HeLa細胞凋亡的活性 (圖4)。

圖 4 9,10-Deacetyl taxinine對 HeLa細胞凋亡的影響Fig.4 The effect of 9,10-deacetyl taxinine on apoptosis of HeLa cell line

4 討論

癌癥是威脅人類健康的一大兇手,是僅次于心腦血管疾病的第二大致死性疾病,嚴重地威脅人類的健康和生命,婦科腫瘤又是臨床最常見的惡性腫瘤,手術和放療是婦科腫瘤常用的治療手段,療效肯定,但是中、晚期患者的治療效果迄今仍較差,5年生存率徘徊在 50%左右。現在臨床上應用的抗癌藥物雖然種類不少,但價格昂貴,毒副作用嚴重,且尚沒有治療某些癌癥的特效藥。因此尋找療效確切,作用機理清楚,治愈率高,毒副作用小的抗癌藥物,攻克癌癥成為全世界醫藥工作者亟待解決的一大課題。植物在其漫長的進化過程中合成了許許多多結構各異的次生代謝天然產物,這些次生代謝產物不僅具有不同的生物活性,還常常被發現有新的作用機制,象紫杉醇 (Taxol)、長春新堿 (Vincristine, VCR)、喜樹堿 (Camptothecin,CPT)就是從植物中發現的三個優秀的天然抗癌藥物中的代表,但彼此具有三個不同的甚至完全相反的抗癌作用機制,這些天然藥物的發現和在臨床上的廣泛應用,極大地推動了化學家和藥學家對抗癌藥物的研發[12,13]。

東北紅豆杉 (Taxus cuspidate)主產我國黑龍江省南部和吉林、遼寧等省,資源豐富,目前從東北紅豆杉中提取分離得到的 130多種紫杉二萜類化合物,其中一些化合物顯示了較好的抗腫瘤、抗炎、抗病毒等生物活性,非紫杉醇類紫杉烷類化合物如taxuspine D、taxezopidine K和 taxagifine顯示出對CaCl2誘導的微管解聚作用有效的抑制活性[14-18]。紫杉烷二萜類制劑除紫杉醇外,還有泰索帝 (docetaxel)等,既可單獨應用,又可與順鉑、卡鉑等化療藥物聯合使用。另外,王建華等[19]對從東北紅豆杉中分離得到的 3種紫杉烷類化合物 2,9-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II、5-acetyltaxuspineW 及 10-acetyltaxuspineB進行抗癌活性研究,發現 3個化合物對人乳腺癌細胞的增值均有明顯的抑制作用。

本實驗利用體外細胞培養方法,觀察了東北紅豆杉中 4種紫杉醇類單體化合物對人子宮頸癌細胞,人子宮內膜癌細胞,人卵巢透明癌細胞和人卵巢囊腺癌細胞增殖的抑制作用,實驗結果表明這 4種化合物中 9,10-去乙酰紫杉寧對 HeLa細胞、HEC-1細胞和 HAC-2細胞均有較強的抑制活性,其半數抑制濃度 (IC50)分別為 19.38μmol/L,32.04μmol/L和 67.22μmol/L,但四種化合物對于正常的細胞,即人胚肺成纖維細胞的增殖不呈現抑制活性。4個化合物均為 6/8/6三環紫杉烷類且 C-13位均含有羰基,化合物 2～4在 C-5位具有肉桂酰基,化合物2和 3在 C-9和 C-10位均是乙酰基,而化合物 4在C-9和 C-10位均是游離的羥基;化合物 1在 C-5位沒有肉桂酰基取而代之的是一個游離的羥基。由此我們推測 C-9,10位的羥基和 C-5位的肉桂酰基是該類化合物抑制腫瘤細胞增殖所必需的。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡 (programmed cell death,PCD),是在一定的生理和病理情況下如細胞內環境的變化或死亡信號觸發等,機體為維護內環境穩定,通過基因調控而使細胞主動死亡的過程。隨著腫瘤分子生物學研究的深入,人們認識到腫瘤的發生和發展不僅與腫瘤細胞的增殖分化異常有關,而且同細胞凋亡的調控失常有關。腫瘤化療的目標就是誘導腫瘤細胞凋亡。目前臨床上使用的大多數抗腫瘤藥物可誘導敏感腫瘤細胞發生凋亡,其抗腫瘤效能與腫瘤細胞在藥物誘導下發生細胞凋亡的內在活性有關[20]。為了進一步探討東北紅豆杉中單體化合物 9,10-去乙酰紫杉寧抑制 HeLa細胞增殖作用的機制,本實驗利用 AnnexinⅤ-FIFC/ PI染色流式細胞儀檢測法測定了 7-乙酰氧基-5-去桂皮酰基紫杉寧誘導 HeLa細胞的凋亡活性,實驗結果顯示,9,10-去乙酰紫杉寧以 50μmol/L處理HeLa細胞 48 h后,HeLa細胞早期凋亡率為 (48.51 ±6.84)%,與 PBS組相比,具有顯著性差異 (P< 0.05)。實驗結果提示東北紅豆杉中單體化合物 9, 10-去乙酰紫杉寧抑制 HeLa細胞增殖作用可能是通過誘導腫瘤細胞凋亡而實現的。我們還將繼續對該類化合物誘導細胞凋亡的作用機制進行深入的研究,尤其是通過哪些基因誘導腫瘤細胞凋亡方面,并著手臨床應用的探索。

致謝:國家自然科學基金(8107255)的資助。

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Anti-proliferation Activity aga inst Tumor Cells of Non-paclitaxel-type Taxoids fromTaxus cuspidateand itsM echan ism

L I Shan1,MA Ru-fei2,WANG Si-ming3,ZHANGMan-li3, WANG Yu-fang3,DONGMei2＊,SH IQing-wen3,ZHANG Hong-zhen11The First Affiliated Hospital of HebeiM edical Uninversity,Shijiazhuang 050031,China;2Departm ent of ForensicM edicine,HebeiM edical Univercity,Shijiazhuang 050017,China;3Depar tm ent of M edicinal Natural Product Chem istry,School of Phar m aceutical Sciences,HebeiM edical University,Shijiazhuang 050017,China

Four non-paclitaxel-type taxoids taxuspine(1),taxinine(2),1β-hydroxyl-taxinine(3),and 9,10-deacetyl taxinine(4)were isolated fromTaxus cuspidata.Their anti-proliferation effects on the cell lines of HeLa,HEC-1, SH IN3,HOC-21,and HAC-2 were evaluated by usingMTT assay.In addition,the structure activity relationship and the possible mechanism were discussed.The results showed that only compound 4 exhibited significant anti-proliferation activities against HeLa,HEC-1,and HAC-2 cell lines and 9,10-hydroxyl and 5-cinnamoyl group were essential for the activity.Furthermore,the apoptosis induced by 9 in Hela cellwas studied by Flow Cytometry(FCM),which indicated that the anti-proliferation activity of 9,10-deacetyl taxinine was achieved by inducing HeLa cell apoptosis probably.

Taxus cuspidata;non-paclitaxel-type taxoids;human tumor cell lines;anti-proliferation activity;apoptosis

1001-6880(2010)06-1109-05

2009-05-14 接受日期:2010-07-07

國家自然科學基金(8107255)

＊通訊作者 Tel:86-311-8626-5602;E-mail:meidong@hebmu.edu.cn

R914;R284.3;Q946.91

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