5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮的生理活性初探

董麗麗,金大成,樸仁哲,金仁君,孫東植,田官榮,李熙峰＊

1長白山生物功能因子省部共建教育部重點實驗室延邊大學,延吉 133002; 2延邊大學農(nóng)學院,龍井 133400;3延邊大學醫(yī)學部,延吉 133002

5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮的生理活性初探

董麗麗1,金大成1,樸仁哲2,金仁君3,孫東植3,田官榮1,李熙峰1＊

1長白山生物功能因子省部共建教育部重點實驗室延邊大學,延吉 133002;2延邊大學農(nóng)學院,龍井 133400;3延邊大學醫(yī)學部,延吉 133002

本文報道了原白頭翁素衍生物 5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮的合成和抗癌活性及其抑制農(nóng)作物病原菌活性的探討結果,表明在 5～20μg/mL范圍內(nèi),5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮對人肺癌A549細胞株有明顯的抑制生長的作用;在 50～200μg/mL范圍內(nèi),其對玉米大斑病菌等的生長抑制率可達到 95%以上。

白頭翁;原白頭翁素;5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮;肺癌A549細胞株;玉米大斑病菌

白頭翁 (Pulsatilla chiensis)是長白山區(qū)常見的毛茛科植物,其干燥根作為中藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,性寒、味苦,具有清熱解毒,涼血止痢,燥濕殺蟲等功效[1],其化學成分的分離、結構確定以及生理活性研究與探討曾很受人們關注[2]。白頭翁的水提取液具有抗腫瘤的作用[3];乙醇提取物具有抗菌活性[4]。最近,樸仁哲等人報導了白頭翁提取液對植物的化感作用[5]。前人的研究表明,白頭翁內(nèi)的毛茛甙 (Ranunculin)可發(fā)生脫糖而轉(zhuǎn)變成原白頭翁素(Protoanemonin),而這原白頭翁素易二聚成無活性的白頭翁素(Anemonin),其轉(zhuǎn)變過程如下。

早在 1949年,Thimann等報導了原白頭翁素可以抑制其他植物生長[6]。孫熊鳴等人用乙酰丙酸為原料合成原白頭翁素,經(jīng)生理活性研究,發(fā)現(xiàn)原白頭翁素顯示卓越的殺蟲活性[7]。毛茛甙作為原白頭翁素的前體,對于口腔癌 KB和肝癌細胞 Bel-7402顯示卓越的抑制活性[8]。Seong cheol Bang等人的研究表明,毛茛甙和原白頭翁素對 A-549. N I H3T等癌細胞顯示相同的活性[9],根據(jù)這一結果,作者提出原白頭翁素是毛茛甙的活性因素。

從結構上看,題目化合物是溴原子取代毛茛甙的葡萄糖基產(chǎn)物,也是原白頭翁素 5-6位碳碳雙鍵上加成溴化氫的產(chǎn)物,因能在生物體內(nèi)脫去溴化氫轉(zhuǎn)化成原白頭翁素,又是原白頭翁素的前體,可顯示一定的生物活性。本文報導了其合成和生物活性檢驗的初步結果,可能的轉(zhuǎn)化過程如下。

1 實驗材料

丙二酸 (天津市光復精細化工研究所)、吡啶(天津市大茂化學試劑廠)、丙烯醛 (中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司)、無水硫酸鈉 (天津市科密歐化學試劑有限公司)、碳酸氫鈉(沈陽市沈新試劑廠)、亞硫酸氫鈉(中國醫(yī)藥公司北京采購供應站)、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷(沈陽力誠試劑廠),以上試劑均為分析純;Br2、HCl、H2SO4(延吉三福化工試劑公司)為化學純;水為二次蒸餾水。

腫瘤細胞株:人肺癌 A549細胞株購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,本研究中傳代培養(yǎng);新生小牛血清(Newborn calf Serum):購于北京華美生物工程公司,經(jīng) 56℃水浴滅活 30 min,-20℃冰柜凍存;MTT(噻唑蘭):購于北京華美生物工程公司;胰蛋白酶:購于北京華美生物工程公司。供試菌種:突臍蠕胞屬玉米大斑病菌 (Exserohilum turcicum)、彎孢屬玉米彎孢葉斑病菌 (Curvularia lunata boed)、半知菌亞門鐮刀屬黃瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、半知菌辣椒炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporiodies)。

2 實驗部分

2.1 題目化合物的合成

本文中題目化合物是按 Scheme 1所示的路線合成的[10]。

圖 1 題目化合物的合成路線Fig.1 Synthetic pathway of the title compound

2.1.1 2,4-戊二烯酸的合成

250 mL四口瓶中,放進 10.4 g(0.1 mol)丙二酸和 8.0 mL(0.1 mol)吡啶,升溫至 70℃待丙二酸全溶后,開動磁力攪拌,用緩慢滴加 7.0 mL(0.1 mol)丙烯醛,滴加完后繼續(xù)保持 70℃溫度 4 h。冷卻至室溫,加入 1:1 HCl 12 mL,再加入 30 mL H2O。用乙酸乙酯萃取 3次,有機層用無水 Na2SO4干燥,蒸去溶劑,得到黃色的針狀固體 18.4 g,收率69%。1H NMR(CDCl3,300 MHz):δ5.54～5.70 (m,2H),5.91(d,J=15.4 Hz,1H),6.44～6.56 (m,1H),7.28～7.41(m,1H),12.07(s,1H);13C NMR(CDCl3,75 MHz)δ:121.5,126.7,134.5, 146.9,172.4。

2.1.2 5-溴-4-羥基-2-烯戊酸的合成

1000 mL四口瓶中,加入 18.4 g(0.19 mol)2, 4-戊二烯酸,在攪拌下倒入溶有 80 g(0.95 mol)碳酸氫鈉的 600 mL蒸餾水溶解,緩慢滴加 12 mL (0.23 mol)Br2,滴畢繼續(xù)攪拌約 18 h,用 1:1 H2SO4調(diào)至 pH=2,用CH2Cl2萃取 3次,水層加入適量的亞硫酸氫鈉,用乙酸乙酯萃取 3次,乙酸乙酯層經(jīng)濃縮后加入適量蒸餾水,用乙醚萃取 3次,乙醚層用無水Na2SO4干燥,濃縮得到淡黃色油狀物 15.5 g,收率 53%。1H NMR(acetone,300 MHz)δ:.51～3.63 (m,2H),4.61～4.62(m,1H),6.14(dd,J=16.0, 1.5 Hz,1H),6.98(dd,J=16.0,5.0 Hz,1H);13C NMR (acetone,75 MHz)δ:36.8,69.8,121.9, 147.6,166.7。

2.1.3 5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮的合成

稱取25.6 g(0.13 mol)5-溴-4-羥基-2-烯戊酸,加入 750 mL蒸餾水和 52 mL 1:1 HCl溶液,充分溶解后,在光化反應器中用汞燈光照 2 h,用 CH2Cl2萃取 3次。水層繼續(xù)進行光照,重復上面的步驟三次。合并三次的有機層濃縮得到淡黃色油狀物 9.24 g,收率為 40%。1H NMR(CDCl3,300 MHz)δ:3.49 (dd,J=10.6,7.1 Hz,1H),3.69(dd,J=10.6,4.6 Hz,1H),5.28～5.32(m,1H),6.29(d,J=5.5 Hz, 1H),7.56(d,J=5.5 Hz,1H);13C NMR(CDCl3,75 MHz)δ:30.3,80.6,123.5,153.9,171.9。從核磁共振數(shù)據(jù)看,最后一步得到的確實是目的化合物。

2.2 題目化合物的生物活性

2.2.1 抗癌活性檢驗

2.2.1.1 藥物的配制

5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮用少量的吐溫-80溶解后再溶解于生理鹽水中,使用前在配制成所需要的濃度。

2.2.1.2 細胞培養(yǎng)液配制

RPM IMedium 1640(北京華美生物工程公司產(chǎn)品)10.4 g溶于 1000 mL雙蒸水中,加 2.0 g NaHCO3,加入 100 u/mL青霉素,100 u/mL鏈霉素,用正壓除菌后,零下 20℃冰柜凍存,用時溶解后加入10%小牛血清,4℃冰箱保存?zhèn)溆?(腫瘤細胞培養(yǎng)用)。

2.2.1.3 細胞復蘇與培養(yǎng)

人肺癌A549細胞株凍存于零下 80℃冰箱中,臨用前復蘇后做實驗。用 RP M I-1640培養(yǎng)液置于37℃,5%CO2濃度及飽和濕度恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞呈單層貼壁生長,每 2～3 d傳代一次,傳代時用 0.25%胰蛋白酶消化 2～3 min,用培養(yǎng)液吹打制成細胞懸液,按所需濃度接種。肺癌細胞傳代之生長旺盛,于實驗前24 h半量換液,用 4 g/L臺盼藍染色3 min,觀察活細胞。本實驗所用的細胞活性均在98%以上。

2.2.1.4 實驗分組及藥物處理

人肺癌A549細胞隨機分為 1個對照組和 3個實驗組,實驗組里分別加 5、10、20μg/mL終濃度的藥物,每個小組分別培養(yǎng) 12、24、48、72 h,在 4個時間段里觀察細胞的變化。對照組除加等體積的生理鹽水代替用藥外,其余步驟與用藥組完全相同。將對數(shù)生長期的細胞按所需濃度接種,待 4 h后細胞完全貼壁,加藥物處理,培養(yǎng)至預定時間,進行相應實驗。

2.2.1.5 MTT法體外細胞毒活性測定

取對數(shù)生長期人肺癌A549細胞以 0.25%胰蛋白酶消化后,制成細胞濃度為 10×105個/mL細胞懸液,接種于96孔細胞培養(yǎng)板上,每孔加0.2 mL細胞懸液,置于 37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待大部分細胞貼壁后,實驗組加入不同濃度的藥物 20 μL,使其終濃度分別為 5、10、20μg/mL對照組加入20μL生理鹽水作為陰性對照,每組重復 3個復孔。培養(yǎng)細胞 12、24、48及 72 h后,每孔加MTT(濃度為5 mg/mL)溶液 20μL,置于 37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng) 4 h后棄去全部上清液,每孔加入二甲基亞砜 (DMSO)200μL,輕輕振蕩 10 min后,用酶標儀在 490 nm波長下測定每孔的吸光度值(A)值。

2.2.2 農(nóng)藥活性檢驗

采用瓊膠平板法 (PSA培養(yǎng)基),在無菌條件下,取一定量的白頭翁衍生物溶液加入到已融化的培養(yǎng)基(滅菌后冷卻 45～50℃),稀釋濃度分別為25、50、100、200μg/mL,搖勻后趁熱倒入直徑為 9 cm的培養(yǎng)皿中制成平板,不加藥劑為對照組。待平板凝固后接入已培養(yǎng)好的、生長一致的各供試病菌的小菌餅(直徑為 6 mm)。每皿一塊,每處理重復 3次,于 26℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待對照組病原菌長滿整個皿后,用十字交叉法測量供試真菌菌落生長直徑。

3 結果與討論

3.1 題目化合物的抗癌活性

MTT法檢測結果表明,題目化合物在體外,在 5～20μg/mL范圍內(nèi),對人肺癌A549細胞株有明顯的抑制生長的作用,且呈現(xiàn)出濃度和時間的依賴性(見表 1),計算公式為:增殖抑制率 (%)=(1-加藥孔A值/對照組A值)×100%。

3.2 題目化合物的農(nóng)藥活性

四種供試病原菌都隨著藥品濃度的不斷升高抑制率也不斷增加。其中,玉米大斑病菌表現(xiàn)最為明顯,在 50μg/mL濃度時抑制率已達到 95%,玉米彎孢葉斑病菌抑制率也達到了 85%,黃瓜枯萎病菌在濃度 50μg/mL時抑制率增加不大,而在濃度為 200 μg/mL時抑制率增加到 76%,辣椒炭疽病菌隨藥品濃度升高抑制率增加平穩(wěn),在最大濃度處理時抑制率達到 62%。從圖 1可知玉米大斑病菌對此藥劑反映最為敏感,抑制作用最好,其計算公式為:菌落直徑 (mm)=測量菌落直徑 -6.0;抑制率 (%)= (對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑 × 100%。

表 1 題目化合物對人肺癌A549細胞株的生長抑制作用Table 1 Inhibition of the title compound on hyperplasy ofA549 human lung cancer cells

圖 1 題目化合物對四種病原菌的抑制曲線Fig.1 Inhibition curve of the title compound on four pathogeny bacteriums

4 結論

5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮作為原白頭翁素的衍生物,可以看作是原白頭翁素的前體,顯示同原白頭翁素類似的生物活性。至于在生物體內(nèi)是否轉(zhuǎn)變成原白頭翁素有待于繼續(xù)研究,我們正在進行持續(xù)的研究,相關研究結果將在今后陸續(xù)發(fā)表。

致謝:本研究得到吉林省科技廳的資助,在此表示感謝。

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The Studies of Biological Activities of 5-Bromomethyl-2(5H)-furanone

DONGLi-li1,J IN Da-cheng1,P IAO Ren-zhe2,J IN Ren-jun3,SUN Dong-zhi3,T IAN Guan-rong1,L IXi-feng1＊1Key Laboratory of O rganism Functional Factors of the ChangbaiM ountain,M inistry of Education,Yanbian University,Yanji 133002,China;2Agricultural College of Yanbian University,Longjing 133400,China;3Health Science Center of Yanbian University,Yanji 133002,China

5-Bromomethyl-2(5H)-furanone was synthesized and its biological activities were tested in this paper.The MTT test showed that 5-bromomethyl-2(5H)-furanone in concentration of 0.25,5,10μg/mL could inhibit the hyperplasy ofA549 human lung cancer cells in a dosage– time-dependentmanner.The growth of Exserohilum turcicum was inhibited completely in concentration of 50-200μg/mL.

Pulsatilla chiensis;protoanemonin;5-bromomethyl-2(5H)-furanone;A549 human lung cancer cells;Exserohilum turcicum

1001-6880(2010)02-0319-04

2008-06-10 接受日期:2008-10-27

吉林省科技廳 2007年項目(20070557)

＊通訊作者 Tel:86-433-2733063;E-mail:xifengli6@yahoo.com.cn

R963;O622.2

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