植物內(nèi)生真菌殺螺活性菌株篩選

韓邦興,陳 鈞,周曉坤,房偉偉,劉一丹,郝 蕾,牛成成

1江蘇大學(xué)藥學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心,六安 237012

植物內(nèi)生真菌殺螺活性菌株篩選

韓邦興1,2,陳 鈞1＊,周曉坤1,房偉偉1,劉一丹1,郝 蕾1,牛成成1

1江蘇大學(xué)藥學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心,六安 237012

分別從醉魚草和水菖蒲中分離出 99、103株內(nèi)生真菌,按照WHO殺螺劑浸泡試驗(yàn)法觀察不同內(nèi)生真菌以及不同濃度發(fā)酵液殺螺效果,用河蝦急性毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)其對(duì)非靶水生生物毒性。結(jié)果表明 LL3026、S38、S21菌株發(fā)酵液有較高的殺螺活性,發(fā)酵液濃度為 10%時(shí),釘螺死亡率為 100.0%;對(duì)河蝦急性毒性較小。

醉魚草;水菖蒲;內(nèi)生真菌;釘螺;殺螺活性

血吸蟲病嚴(yán)重危害人類健康,釘螺是血吸蟲的中間宿主。因此,消滅釘螺是控制血吸蟲病傳播的重要策略[1]。目前使用的化學(xué)滅螺劑對(duì)非靶生物,尤其是對(duì)魚類有很大毒性,加之價(jià)格昂貴,從而限制其應(yīng)用[2]。因此,進(jìn)行生物滅螺方法研究及生物滅螺劑的開發(fā),彌補(bǔ)化學(xué)殺螺劑的不足具有十分重要的意義。在此背景下,微生物滅螺劑篩選方興未艾[3],并篩選出一些能有效殺滅釘螺的菌株[4-6]。

內(nèi)生真菌(Endophytic fungus)是指其生活史上一定階段生活在活體植物組織內(nèi),但對(duì)植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌。植物內(nèi)生真菌種類豐富,代謝產(chǎn)物活性多樣,是天然活性物質(zhì)的重要來源[7-8],已成為近年來的研究熱點(diǎn)[9]。

本研究室篩選到有效殺螺植物醉魚草和水菖蒲(另文報(bào)道),目前,還沒有關(guān)于醉魚草、水菖蒲長(zhǎng)期相互作用及共同進(jìn)化的內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物活性研究。本研究以從醉魚草葉和水菖蒲葉中分別分離得到的 99、103株內(nèi)生真菌為供試菌株,進(jìn)行殺螺活性篩選,為開發(fā)新型微生物滅螺劑研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

TDL-5-A飛鴿離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器制造廠;SPX-250B生化培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)集團(tuán);QYC-211搖床,上海福瑪試驗(yàn)設(shè)備有限公司;氯硝柳胺,江蘇省血吸蟲病防治研究所提供。

1.2 供試材料

植物材料:醉魚草 B uddleia lindleyana,2008年10月采自安徽中醫(yī)學(xué)院藥用植物園,經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院彭華勝副教授鑒定。水菖蒲 Acorus gram ineus,2008年 10月采自江蘇省鎮(zhèn)江市,經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院陳鈞教授鑒定。

供試釘螺:釘螺采自江蘇省鎮(zhèn)江市長(zhǎng)江邊,系湖北釘螺指名亞種 Oncom elania hupensis,由鎮(zhèn)江市疾病控制中心韓方岸主任醫(yī)師鑒定。釘螺于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 d,挑選活力強(qiáng)的釘螺供室內(nèi)殺螺試驗(yàn)。

供試河蝦:河蝦采自江蘇省鎮(zhèn)江市長(zhǎng)江邊,學(xué)名日本沼蝦M acrobranchium nipponense,由江蘇大學(xué)韓邦興博士鑒定。

培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基 (馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基),臨用時(shí)每毫升培養(yǎng)基中加 80單位的青霉素以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.3 內(nèi)生真菌分離

自來水洗凈醉魚草葉、水菖蒲葉及莖,分別剪成小段(片),于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行表面滅菌。滅菌后的材料植入 PDA平板,置 (28±1)℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待莖、葉切面處長(zhǎng)出菌絲后,挑取其尖端部分接至新的 PDA平板上,28℃培養(yǎng),經(jīng)反復(fù)純化后,得醉魚草和水菖蒲內(nèi)生真菌純培養(yǎng)物。菌株編號(hào)后轉(zhuǎn)入 PDA斜面,于 4℃冰箱保藏備用。

1.4 內(nèi)生真菌發(fā)酵

從斜面挑取純化菌種接種于 PDA平板上,待生長(zhǎng)旺盛后,用接種針挑取菌落,接種于裝有 PDA液體培養(yǎng)基的搖瓶中。每搖瓶 (1000 mL)裝入 200 mL。培養(yǎng)基均需 0.1 MPa、121℃、保溫 30 min滅菌。搖瓶靜置 24 h后,置于恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度 28℃,轉(zhuǎn)速為 120 r/min,培養(yǎng)時(shí)間為 7 d。將內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物用 4層無菌紗布過濾,濾液 3 000 r/min離心 15 min,棄去沉淀,取上清液,備用。

1.5 殺螺試驗(yàn)

取發(fā)酵液50 mL,用去氯離子水定容至100 mL,即配制成 50%發(fā)酵液。浸泡 10只釘螺,另設(shè) 1 mg/ L氯硝柳胺水溶液和去氯離子水對(duì)照。于 48 h后,棄去藥液,用去氯離子水沖洗釘螺 3次,復(fù)蘇 48 h,水測(cè)法和壓碎法統(tǒng)計(jì)釘螺的死亡數(shù)量。水測(cè)法是將待測(cè)釘螺浸泡于去離子清水中,置于室溫下 48 h,凡能爬壁或吸附于壁的皆為活螺。未吸附于壁的,繼用壓碎法檢測(cè)。用上述 50%的發(fā)酵液篩選出殺螺率為 100%的菌株,再按上述方法配制成試驗(yàn)所需要的濃度進(jìn)行殺螺活性復(fù)篩。各組試驗(yàn)重復(fù) 3次。所有去氯離子水組死亡率為 0%,氯硝柳胺組死亡率為100%。

1.6 河蝦急性毒性試驗(yàn)

取發(fā)酵液配制成 2、4、6、8、10%發(fā)酵液。每1000 mL稀釋后的發(fā)酵液放養(yǎng) 10只河蝦,另設(shè)去氯離子水對(duì)照。試驗(yàn)過程中及時(shí)撈去死蝦。分別于24、48、72 h統(tǒng)計(jì)死亡河蝦數(shù)。各組試驗(yàn)重復(fù) 3次。所有去氯離子水組死亡率為0%。

1.7 數(shù)據(jù)處理

以釘螺和河蝦死亡率為參考序列,應(yīng)用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均值化和差異性處理,比較各菌株發(fā)酵液殺滅釘螺效果和對(duì)河蝦的急性毒性。

2 結(jié)論與討論

2.1 醉魚草內(nèi)生真菌殺螺活性菌株篩選

從醉魚草葉中分離出 99株內(nèi)生真菌。采用WHO推薦的殺螺劑浸泡試驗(yàn)法對(duì)醉魚草內(nèi)生真菌的殺螺活性進(jìn)行初步篩選。50%發(fā)酵液 48 h殺螺結(jié)果表明,55株菌株發(fā)酵液殺螺率在 80%以上,占分離的內(nèi)生真菌總數(shù) 55.6%。其中LL3026等 7株菌株發(fā)酵液殺螺率為 100%。25%發(fā)酵液 48 h殺螺結(jié)果顯示,僅 L50198、LL3026發(fā)酵液殺螺率為100%。經(jīng) 12.5%發(fā)酵液 48 h殺螺試驗(yàn),LL3026菌株發(fā)酵液殺螺率仍為 100%。見圖 1。

圖 1 醉魚草內(nèi)生真菌發(fā)酵液的殺螺活性Fig.1 Molluscicidal activity againstOncomelania hupensisof endophyte fungus fromAcorus gram ineus

2.2 水菖蒲內(nèi)生真菌殺螺活性菌株篩選

從水菖蒲中分離出 103株內(nèi)生真菌。采用WHO推薦的殺螺劑浸泡試驗(yàn)法對(duì)水菖蒲內(nèi)生真菌的殺螺活性進(jìn)行初步篩選。50%發(fā)酵液 48 h殺螺結(jié)果表明,39株菌株發(fā)酵液殺螺率在 80%以上,占分離的內(nèi)生真菌總數(shù) 37.9%。其中 S21等 12株菌株發(fā)酵液殺螺率為 100%。25%發(fā)酵液 48 h殺螺結(jié)果顯示,僅 S21、S38菌株發(fā)酵液殺螺率為 100%。經(jīng) 12.5%發(fā)酵液 48 h殺螺試驗(yàn),S21、S38菌株發(fā)酵液殺螺率仍為100%。見圖2。

圖 2 水菖蒲內(nèi)生真菌發(fā)酵液的殺螺活性Fig.2 Molluscicidal activity againstOncom elania hupensisof endophyte fungus fromBuddleia lindleyan

2.3 三株殺螺活性菌株活性研究

為進(jìn)一步研究 LL3026、S38、S21對(duì)釘螺的殺滅效果,設(shè)置2%～10%濃度梯度的發(fā)酵液進(jìn)行殺螺試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明,三株內(nèi)生真菌不同濃度梯度的發(fā)酵液均具有較好的殺螺效果,并都有很強(qiáng)的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。LL3026不同濃度發(fā)酵液 24 h殺螺效果不太理想,殺螺率僅達(dá) 23.3%～43.3%;而 2%發(fā)酵液 48 h殺螺率可達(dá) 83.3%,4%發(fā)酵液殺螺率即達(dá) 100%。所有濃度發(fā)酵液72 h殺螺率都達(dá) 100%。S38不同濃度發(fā)酵液 24 h殺螺率高于LL3026,達(dá) 30%～80%;但 48 h和 72 h殺螺率稍低于LL3026,2%發(fā)酵液 48 h殺螺率為 65%,6%發(fā)酵液 48 h殺螺率為 100%。而 2%發(fā)酵液 72 h殺螺率為 95%,其余濃度殺螺率都達(dá) 100%。三株內(nèi)生真菌中,S21殺螺效果相對(duì)最弱,各濃度 24 h殺螺率為10%～50%,48 h殺螺率為 30%～90%;10%發(fā)酵液 72 h殺螺率達(dá) 100%。見圖 3。

圖 3 LL3026,S38和 S21菌株不同濃度發(fā)酵液殺螺活性Fig.3 Molluscicidal activity againstOncom elania hupensis ofLL3026,S38 and S21 broth at the different concertration

2.4 三株殺螺活性菌株的河蝦急性毒性

為考察LL3026、S21、S38三株內(nèi)生真菌對(duì)非靶水生生物的毒性,本試驗(yàn)選擇河蝦為受試對(duì)象,以死亡率為指標(biāo)進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,S21各濃度發(fā)酵液對(duì)河蝦幾無致死作用,10%發(fā)酵液 72 h死亡率僅 20%。LL3026對(duì)河蝦的致死作用相對(duì)較小,各濃度發(fā)酵液 24 h死亡率最高為 25%,當(dāng)發(fā)酵液濃度超過 6%時(shí),48 h和 72 h河蝦死亡率明顯上升,分別達(dá) 35%～90%,50%～95%。S38菌株發(fā)酵液在三者中對(duì)河蝦毒性最大,10%發(fā)酵液對(duì)河蝦24 h死亡率即達(dá) 80%,隨時(shí)間和濃度增加,S38菌株發(fā)酵液對(duì)河蝦急性毒性也逐漸增加,10%發(fā)酵液 72 h死亡為 100%。見圖 4。

圖 4 LL3026,S38和 S21菌株不同濃度發(fā)酵液的河蝦急性毒性Fig.4 M acrobranchium nipponense toxicity assay of LL3026,S38 and S21 broth at the different concertration

2.5 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,醉魚草和水菖蒲中內(nèi)生真菌種類豐富,且廣泛分布著殺螺活性菌株,分別占分離菌株總數(shù)的 55.6%和 37.9%;其中 LL3026、S21、S38發(fā)酵液具有很強(qiáng)的殺螺活性,4%的 LL3026發(fā)酵液48 h殺螺率 100%,6%的 S38發(fā)酵液 48 h殺螺率100%,10%的 S21發(fā)酵液 72 h殺螺率 100%。三株菌株的殺螺活性均高于本實(shí)驗(yàn)室曾篩選到金錢松內(nèi)生真菌 JJ18(10%發(fā)酵液 72 h殺螺率為 86.7%)[8]。并且在一定濃度下,發(fā)酵液對(duì)釘螺的毒性遠(yuǎn)大于對(duì)河蝦的毒性。

從安全、有效的角度考慮,植物內(nèi)生真菌殺螺研究有廣闊的前景。至今,對(duì)內(nèi)生真菌的殺螺研究還處于一個(gè)初始階段,相對(duì)于數(shù)量龐大的內(nèi)生真菌種類而言,才剛剛開始[8]。將植物內(nèi)生真菌的研究與殺螺研究相結(jié)合,應(yīng)用生物組合化學(xué)的方法進(jìn)行活性成分篩選,發(fā)現(xiàn)安全、有效的殺螺先導(dǎo)化合物,應(yīng)用生物技術(shù)改良內(nèi)生真菌,提高活性成分的含量和產(chǎn)量,對(duì)推動(dòng)生物殺螺劑的篩選和可持續(xù)利用具有重要意義。

醉魚草和水菖蒲中內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生了殺螺活性物質(zhì),可以針對(duì)性地進(jìn)行活性跟蹤研究[10],分離篩選有效的活性物質(zhì),并采用生物技術(shù)手段提高活性成分含量和產(chǎn)量,使之成為新型殺螺劑的重要來源。

致謝:感謝安徽中醫(yī)學(xué)院王德群教授、彭華勝副教授、江蘇省血吸蟲病防治研究所梁幼生研究員和江蘇省鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心韓方岸主任醫(yī)師給予的支持!

1 dos Santos AF,de Azevedo DP,dos Santos Mata Rda C,et al.The lethality of Euphorbia conspicuato adults ofB iom phalaria glabrata,cercaria ofSchistosom a m ansoniand larvae of A rtem ia salina.B ioresour Technol,2007,98:135-139.

2 Andrews P,Thyssen J,LorkeD.The biology and toxicologyof molluscicides,bayluscide.Phar m acol Therapeut,1982,2: 245-295.

3 Zhou XN(周曉農(nóng)).Science on Oncomelannia Snails(實(shí)用釘螺學(xué)).Beijing:Science Press,2005.95-96.

4 Tan P(譚蘋),Yang JM(楊建明),Xiao RF(肖瑞芬),et al.Influence of Streptomyces violaceoruber on the enzymehistochemistry inOncom elania hupensis.Acta Zoologica Sinica(動(dòng)物學(xué)報(bào)),2006,52:109-114.

5 Chen XL(陳祥麟).Molluscicidal activity againstOncom elania hupensisof pseudomonad.M icrobiology(微生物學(xué)通報(bào)),1983,10:215-217.

6 Yao CS(姚超素),Hu DY(胡代炎),ShiMZ(石孟芝),et al.Studies on snail killing antibiotic 230.Chin J Antibiotics (中國抗生素雜志),1993,18:261.

7 Suthep W iyakrutta,Nongluksna Sriubolmas,Wattana Panphut,et al.Endophytic fungi with antimicrobial,anticancer and antimalarial activities isolated from Thai medicinal plants.J M icrobiol B iotechn,2004,20:265-272.

8 Guo SB(郭尚彬),Chen J(陳鈞),Wang Y(王妍),et al. Experimental research on molluscicidal effect of endophyte JJ18 fromPseudolarix am abilis.China J Chin M ateria M ed (中國中藥雜志),2008,34:389-392.

9 He RQ(赫榮喬).Plant endophyte becomes one of hot topics in the current microbiological study in China.M icrobiology (微生物學(xué)通報(bào)),2009,36:1

10 Ni Z W(倪志偉),Li GH(李國紅),Zhao PJ(趙沛基),et al.Antimicrobial Components of the Endophytic Fungal Strain Chaetomium globosum Ly50'fromM aytenus hookeri. Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2008,20:33-36.

Screen ing ofM olluscicidal Activity aga instOncom elania hupensisof Endophyte Fungus

HAN Bang-xing1,2,CHEN Jun1＊,ZHOU Xiao-kun1,FANGWei-wei1,L IU Yi-dan1,HAO Lei1,N IU Cheng-cheng11School of Phar m acy,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;2Research Center of Plant Cell Engineering of Anhui Province,Lu’an 237012,China

Molluscicidal testswere performed according to the immersion test suggested byWHO to screen molluscicidal activity endophyte funguswhichwere isolated from Buddleia lindleyana andAcorus gramineus.TheMacrobranchium nipponense toxicity assaywas used to appraise toxicity to non target aquatic species.The result indicated that the LL3026, S38 and S21 broth had significant activity against Oncomelania hupensis.The mortality rates of snails immersed by LL3026,S38 and S21 broth were 100.0%at the concertration of 10%,respectively.The endophyte fungus had no acute toxicity toMacrobranchium nipponense.

Buddleia lindleyana;Acorus gram ineus;Endophyte;Oncom elania hupensis;Molluscicidal effect

1001-6880(2010)02-0315-04

2009-08-24 接受日期:2009-11-24

＊通訊作者 Tel:0511-88780196,Email:syxchenjun@126.com

R383.24

A