酶解骨膠原多肽的抗氧化特性研究

李 珂,楊秀華,扈 麟,李宗軍

食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,長沙 410128

酶解骨膠原多肽的抗氧化特性研究

李 珂,楊秀華,扈 麟,李宗軍＊

食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,長沙 410128

本文主要研究了酶解法制備的骨膠原多肽的總抗氧化能力、羥自由基清除作用和抑制超氧陰離子自由基的能力。通過與谷胱甘肽(GSH)的比較發(fā)現(xiàn),溶液濃度在 100～150 mg/mL時,該骨膠原多肽的總抗氧化能力為 GSH的 71.92%。溶液濃度在 2.5～20 mg/mL時,該多肽羥自由基清除作用為谷胱甘肽的 1.36倍。溶液濃度為 10～150 mg/mL時,多肽抑制超氧陰離子自由基的能力低于谷胱甘肽。

骨膠原多肽;總抗氧化能力;羥自由基清除作用;抑制超氧陰離子自由基能力

正常人體內(nèi)的自由基處于產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡之中,如果自由基產(chǎn)生過多或清除過慢,會對生物體產(chǎn)生一系列損害,加速衰老并誘發(fā)各種疾病[1,2]。人類及動物許多疾病與自由基代謝失衡有關(guān),如癌癥、糖尿病、心血管疾病、老年性癡呆、關(guān)節(jié)炎、胃潰瘍、動脈硬化等[3-5],補(bǔ)充外來抗氧化活性物質(zhì)能降低機(jī)體自由基水平,防止脂質(zhì)過氧化,幫助機(jī)體抵御疾病,延緩衰老[6]。抗氧化肽以其分子量小、易吸收、活性強(qiáng)等特點受到重視,在醫(yī)藥、化妝品、保健品和食品與飼料添加劑型等方面有廣闊前景。

蛋白酶水解骨膠原多肽產(chǎn)物中存在多種抗氧化肽,它們具較強(qiáng)抑制生物大分子過氧化、清除體內(nèi)自由基、美容、保濕、增加皮膚彈性、促進(jìn)鈣質(zhì)沉降等功能[7-10]。目前國內(nèi)外酶解大豆蛋白、乳蛋白、魚類蛋白、雞蛋卵白蛋白獲得具有抗氧化功能多肽的研究報道較多,對于酶解動物骨骼獲得具有抗氧化功能多肽的研究報道較少。本文主要研究前期通過優(yōu)化酶解條件制備出的骨多肽粉的抗氧化特性。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

多肽粉:自制(工藝流程:豬骨→清洗破碎→加水 121℃蒸煮 30 min→去脂→干燥→粗粉碎→超微粉碎→骨粉→配制成濃度為 15%(W/W)的骨泥→90℃殺菌 10 min→調(diào) pH 7.5→按酶底比 0.25%加酶 (Protamex復(fù)合蛋白酶,丹麥諾維信公司生產(chǎn))→55℃酶解 12 h→85℃滅酶 10 min→過濾→多肽液真空濃縮→冷凍干燥→成品)。

制成的多肽粉成品為多肽與少量氨基酸混合物,多肽粉粗蛋白含量為98.91%,氨基酸含量為 12.18%,三氯乙酸(TCA)可溶性蛋白占總蛋白的95%以上。

1.1.2 儀器與試劑

AB-L分析天平(梅特勒-托利多中國);7200型可見分光光度計 (尤尼柯 (上海)儀器有限公司); TY5258低溫冰箱(日本 SANYO)。

還原型谷胱甘肽 (GHS,sigma公司);總抗氧化能力測定試劑盒(南京建成科技有限公司);羥自由基測定試劑盒(南京建成科技有限公司);抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2·-)測試盒 (南京建成科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 總抗氧化能力的測定

總抗氧化能力是指在37℃時,每1 min每1 mL樣品使反應(yīng)體系的吸光度 (OD)值每增加 0.01時,為一個總抗氧化能力單位。其測定采用南京建成科技有限公司的總抗氧化能力試劑盒,按說明書中要求進(jìn)行操作。

1.2.2 羥自由基清除作用的測定

羥自由基清除作用能力是指每毫升樣品在 37℃下反應(yīng) 1 min,使反應(yīng)體系中 H2O2濃度降低 1 mmol/L為一個抑制羥自由基能力單位。其測定采用南京建成科技有限公司的羥自由基測定試劑盒,按說明書中要求進(jìn)行測定。

1.2.3 抑制超氧陰離子自由基能力的測定

抑制超氧陰離子自由基能力是指在反應(yīng)體系中,每升樣品在 37℃反應(yīng) 40 min所抑制的超氧陰離子自由基相當(dāng)于 1 mg的維生素 C所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個活力單位。其測定采用南京建成科技有限公司的抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2·-)測試盒,按說明書中要求進(jìn)行操作。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

總抗氧化能力、羥自由基清除作用、超氧陰離子自由基清除能力檢測試劑盒說明書中要求,對樣本進(jìn)行測定前均需要做預(yù)備試驗,以確定檢測所需最佳濃度范圍。故先做預(yù)備試驗,然后根據(jù)預(yù)備試驗結(jié)果配制最佳檢測濃度范圍內(nèi)的不同濃度的多肽液和谷胱甘肽(GSH)溶液,檢測以上3項指標(biāo),每項檢測均做 7個平行。實驗數(shù)據(jù)采用Minitab14統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 總抗氧化能力

通過預(yù)實驗證明兩種被測溶液濃度范圍在 100～150 mg/mL時吸光值與總抗氧化能力成良好線性關(guān)系。最佳檢測濃度范圍內(nèi)測得的總抗氧化能力結(jié)果見表1。

表 1 不同濃度多肽及谷胱甘肽溶液總抗氧化能力方差分析表Table 1 Variance analysis of total antioxidant capacity of peptide and GSH at different concentrations

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗,結(jié)果表明所測多肽溶液各濃度之間以及谷胱甘肽溶液各濃度之間的總抗氧化性差異極顯著 (P<0.01),多肽及谷胱甘肽溶液濃度為100～150 mg/mL時總抗氧化能力與其濃度成正相關(guān),隨著濃度的升高而增強(qiáng)。相同濃度下兩種溶液的總抗氧化性差異均極顯著 (P<0.01),在溶液濃度為 100～150 mg/mL時,多肽的總抗氧化能力稍低于谷胱甘肽,為谷胱甘肽總抗氧化能力的71.92%。110 mg/mL谷胱甘肽溶液與 130 mg/mL多肽溶液總抗氧化能力的方差分析結(jié)果 F=4.49< F0.05(1,6)=5.99,P=0.056>0.05,說明 110 mg/ mL谷胱甘肽溶液與 130 mg/mL多肽溶液總抗氧化能力并無顯著性差異 (α=0.05),可以認(rèn)為兩者總抗氧化能力基本相等。

2.2 抑制羥自由基的能力

預(yù)實驗證明兩種被測溶液濃度范圍在 2.5～10 mg/mL時吸光值與羥自由基清除作用成良好線性關(guān)系。最佳檢測濃度范圍內(nèi)測得的羥自由基清除作用結(jié)果見表2。

表 2 不同濃度多肽及谷胱甘肽溶液抑制羥自由基能力方差分析表Table 2 Variance analysis of scavenging effect of hydroxyl radical of peptide and GSH at different concentrations

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗,結(jié)果表明所測多肽溶液各濃度之間以及谷胱甘肽溶液各濃度之間的羥自由基清除作用差異極顯著 (P<0.01),多肽及谷胱甘肽溶液濃度為 2.5～20 mg/mL時羥自由基清除作用與其濃度成正相關(guān),隨著濃度的升高而增強(qiáng)。相同濃度下兩種溶液羥自由基清除作用差異均極顯著 (P< 0.01),在溶液濃度為 2.5 mg/mL～20 mg/mL時,多肽羥自由基清除作用為谷胱甘肽的 1.36倍,多肽羥自由基清除作用明顯高于谷胱甘肽。5 mg/mL多肽溶液與 7.5 mg/mL谷胱甘肽溶液羥自由基清除作用的方差分析結(jié)果 F=2.810.05,說明 5 mg/mL多肽溶液與 7.5 mg/ mL谷胱甘肽溶液羥自由基清除作用差異不顯著 (α =0.05),可以認(rèn)為兩者羥自由基清除作用相等。

2.3 抑制超氧陰離子自由基能力

預(yù)實驗證明多肽及谷胱甘肽溶液濃度在 10～50 mg/mL時吸光值與抑制超氧陰離子自由基能力基本成線性關(guān)系。檢測濃度范圍內(nèi)測得的抑制超氧陰離子自由基能力結(jié)果見表 3。

表 3 不同濃度多肽及谷胱甘肽溶液抑制超氧陰離子自由基能力方差分析表Table 3 Variance analysis of inhibiting ability of superoxide anion free radical of peptide and GSH at different concentrations

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗,結(jié)果表明所測多肽溶液各濃度之間以及谷胱甘肽溶液各濃度之間的抑制超氧陰離子自由基能力差異極顯著 (P<0.01),多肽及谷胱甘肽溶液濃度為 10～150 mg/mL時抑制超氧陰離子自由基能力與其濃度成正相關(guān),隨著濃度的增加而增強(qiáng)。相同濃度下兩種溶液抑制超氧陰離子自由基能力差異均極顯著 (P<0.01),谷胱甘肽抑制超氧陰離子自由基的能力要高于多肽。同濃度多肽與谷胱甘肽平均值比較見表 4,從表 4中可以看出隨著濃度的增加,差異逐漸減小。

表 4 多肽與谷胱甘肽抑制超氧陰離子自由基能力比較Table 4 Comparison of inhibiting ability of superoxide anion free radical of peptide and GSH

3 結(jié)論

通過對自制骨膠原多肽與谷胱甘肽 (GSH)抗氧化能力的測定,與谷胱甘肽進(jìn)行對照,結(jié)果表明,該骨膠原多肽具有較強(qiáng)抗氧化能力。在溶液濃度為100～150 mg/mL時,多肽的總抗氧化能力稍低于谷胱甘肽,為谷胱甘肽的 71.92%。該多肽羥自由基清除作用明顯高于谷胱甘肽,在溶液濃度為 2.5～20 mg/mL時,該多肽羥自由基清除作用為谷胱甘肽的 1.36倍。相同濃度下谷胱甘肽抑制超氧陰離子自由基的能力要高于該骨膠原多肽,在 10～150 mg/mL濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增加,兩者抑制超氧陰離子自由基的能力差異逐漸減小。

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Study on Anti-oxidant of Polypeptide from Enzymatic Hydrolysis Bone Collagen

L I Ke,YANG Xiu-hua,HU Lin,L I Zong-jun＊
Province Key Laboratory of Food Science and B iotechnology,College of Food Science and Technology,Hunan Agriculture University,Changsha 410128,China

The total antioxidant capacity,scavenging effect of hydroxyl radical and the inhibit ability of superoxide anion free radical of bone collagen peptide were studied in this passage.Compared with glutathione(GSH),the total antioxidant capacity of such bone collagen peptide,in the range of 2.5-20 mg/mL,was 71.92%of GSH.The scavenging effect of hydroxyl radical of the bone collagen peptide was 1.36 times of GSH,in the range of 2.5-20 mg/mL.While in the range of 10-150 mg/mL,the inhibit ability of superoxide anion free radical of the peptide was lower than GSH.

bone collagen peptide;total antioxidant capacity;scavenging effect of hydroxyl radical;inhibit ability of superoxide anion free radical

1001-6880(2010)02-0311-04

2008-11-18 接受日期:2008-12-16

湖南省重大科技專項 (2007FJ1003);湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金資助

＊通訊作者 Tel:86-731-84673870;E-mail:lizongjun@yahoo.com.cn

R285;TS251;S87

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