雙平板對照篩選跟蹤分離細菌外排泵抑制劑

楊再昌,楊小生,牛玉樂

1貴州大學化工學院,貴陽 550003;2貴州省、中國科學院天然產物化學重點實驗室,貴陽 550004

雙平板對照篩選跟蹤分離細菌外排泵抑制劑

楊再昌1＊,楊小生2,牛玉樂1

1貴州大學化工學院,貴陽 550003;2貴州省、中國科學院天然產物化學重點實驗室,貴陽 550004

建立了細菌外排泵抑制劑的篩選與活性跟蹤方法。準備 2個平板,一個為普通營養瓊脂平板,另一個為含小蘗堿的普通營養瓊脂平板,通過比較兩個平板含藥紙片周圍抑菌圈的直徑大小判斷篩選結果,方法可靠穩定。篩選發現某霉菌提取物對細菌外排泵有抑制活性,經活性跟蹤分離,得到單體化合物,經 NMR鑒定為 4′, 5,7-三羥基異黃酮。方法簡便易行,成本低,適宜于對大批樣本進行快速篩選并在分離時進行活性跟蹤。

篩選;細菌外排泵;抑制劑;雙平板

細菌外排泵 (Bacterial efflux pump)是細菌將胞內毒物運輸到胞外環境的蛋白質。細菌基因組學的研究表明,5%～10%的基因與細菌的物質運輸有關,這部分基因主要編碼外排泵,使細菌能在不利的環境中生存下來。幾乎所有抗生素對細菌來說都是有毒性的,因此抗生素很容易誘導細菌外排泵的超表達,并可導致交叉耐藥,使細菌獲得泵出多種抗菌藥物的能力。另外,超表達外排泵的菌株,還容易導致其它抗菌藥物作用靶點的變異。由此可見,外排泵在細菌耐藥性形成的過程中扮演著重要角色[1]。

近年來的研究表明,外排泵被抑制后,細菌可重新恢復對抗菌藥物的敏感性,為研制抗耐藥菌藥物提供了新的思路。由于大多數外排泵在結構上具有高度的同源性,使發現對多種外排泵均有抑制活性的廣譜抑制劑成為可能,外排泵抑制劑與抗生素組合,將提高或恢復抗生素的抗菌活性[2]。外排泵是跨膜蛋白的一種,依賴質子勢能提供能量,以離體外排泵蛋白為靶點較難實現高通量篩選,基于細胞的篩選方法被廣泛使用。一種方法是用同位素標記外排泵底物(如四環素),通過測定細菌胞內藥物濃度評價抑制劑的活性;另一方法是構建外排泵超表達菌株,通過測定M I C評價抑制劑的活性[3]。這兩種方法對實驗條件要求較高,有一定技術難度。

本實驗將銅綠假單胞菌 (ATCC 27853)在亞抑菌濃度的小蘗堿瓊脂平板中不斷傳代,經利血平、小蘗堿聯合抗菌試驗證明,該菌株對小蘗堿的耐藥性進一步增強。以小蘗堿為該菌株的外排泵底物,建立了篩選細菌外排泵抑制劑的雙平板對照法篩選模型,并采用本法進行活性跟蹤,從微生物發酵產物中分離到活性單體,經NMR鑒定為 4′,5,7-三羥基異黃酮(Genistein),經熒光分光光度法測定細菌胞內外排泵底物小蘗堿的濃度,進一步驗證該單體有抑制細菌外排泵的作用。

1 材料

銅綠假單胞菌為 ATCC 27853標準菌株,由貴州省、中科院天然產物化學重點實驗室贈送,小蘗堿、利血平為 Sigma公司產品,蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂粉為北京雙旋微生物培養基制品廠產品。熒光分光光度計為島津 RF-540。

2 方法

2.1 用小蘗堿誘導銅綠假單胞菌耐藥

按常規方法制小蘗堿含量分別為 350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000μg/mL的營養瓊脂平板,首先劃線接種銅綠假單胞菌于 350μg/mL的營養瓊脂平板上,37℃培養24 h后,釣取生長旺盛的菌落,從低濃度到高濃度,依次接種培養,傳 14代后,菌株用小蘗堿含量為1000μg/mL的營養瓊脂平板維持培養備用。

2.2 細菌外排泵抑制劑的雙平板對照篩選法

銅綠假單胞菌經誘導后在含小蘗堿的營養瓊脂平板中生長良好,接種細菌后,在瓊脂表面貼上紙片,再滴加待篩選的樣本溶液,如果樣本對外排泵有抑制作用,則細菌不能外排小蘗堿,小蘗堿在細菌胞內發揮抗菌作用,致紙片周圍形成抑菌圈。因樣本本身也可能具有抑菌作用,還需檢測樣本對不含小蘗堿的營養瓊脂平板上的相同細菌是否具有抑制作用,不含小蘗堿的平板叫對照平板。如果樣本使含小蘗堿平板的紙片周圍形成抑菌圈,而在對照平板的紙片周圍無抑菌圈,樣本很可能對外排泵有抑制作用,反之,如果一個樣本在兩種平板上都形成抑菌圈,這個樣本應與外排泵抑制作用無關,這個方法即雙平板對照法。具體做法見圖 1,準備 2個 90 mm的培養皿制備瓊脂平板,一個平板為含小蘗堿 256 μg/mL的營養瓊脂平板 (A),另一個為普通營養瓊脂平板(B),樣本用少量甲醇溶解后,用 PBS液(0.2 mol/L,pH 7.2)稀釋成 5 mg/mL的溶液。在平板接種菌液后(105 CFU/mL),貼上紙片,每紙片加 5μL的樣本溶液,紙片載藥量為 25μg,37℃培養 18 h后觀察結果,記錄抑菌圈直徑 (包括紙片直徑)。用利血平(1號紙片,一種已知細菌外排泵抑制劑,0.5 mg/mL)作陽性對照。一次可篩選 3個樣本。

2.3 活性單體的跟蹤分離及結構鑒定

采用雙平板對照篩選法發現某霉菌發酵液能抑制銅綠假單胞菌外排泵,擴大培養得發酵液 5000 mL,減壓濃縮后,分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得 3個提取部位,活性跟蹤發現乙酸乙酯部位活性最強,用硅膠柱分離,用石油醚/乙酸乙酯 (3∶1)洗脫,收集得 30份洗脫液,其中第 18至第 20份均有活性,合并后再經硅膠柱分離,得到淺灰色粉末。測定化合物理化性質,用NMR進行結構鑒定。

2.4 細菌胞內小蘗堿濃度的測定

小蘗堿(Berberine)屬異喹啉類生物堿,進入細菌胞內后,與細菌的DNA分子結合,熒光增強,進入胞內的小蘗堿越多,發出的熒光越強,因此,測定熒光強度可以間接反映細菌胞內小蘗堿的量。測定按文獻方法進行[4],即用MH肉湯培養銅綠假單胞菌致A600為 1.8,菌液離心,棄去上清液,沉淀用 20 mmol/L的 HEPES/NaOH(pH 7.0)緩沖液洗滌 3次,菌液用含葡萄糖 10μmol/L的 HEPES緩沖液調整致A600為 0.3,37℃培養1 h,離心,用HEPES緩沖液洗滌后調整致A600為 0.15。取菌液 3 mL,加入小蘗堿溶液 0.5 mL(120μg/mL)及活性單體化合物溶液 0.5 mL(配成 64、128、256μg/mL三個濃度,每一濃度做 2管),對照管只加小蘗堿及HEPES/NaOH(pH 7.0)緩沖液,在 0、5、10、15、20、25、30 min時段內,分別在激發光波長 355 nm、發射光波長 517 nm的條件下用熒光分光光度計測定熒光強度。

3 結果

銅綠假單胞菌ATCC 27853一般作為藥敏試驗的質控菌株,小蘗堿對該菌株的M I C為512μg/mL,經小蘗堿誘導后,小蘗堿抑制該菌株的M IC>1000 μg/mL,在 1/4 M I C的小蘗堿營養瓊脂平板中,該菌株生長良好,其菌落生長情況與不含小蘗堿的營養瓊脂平板的情況無差異。當小蘗堿濃度提高到1000μg/mL時,該菌株雖然未能被殺死,但菌落變小,生長不良。

雙平板對照篩選法顯示(圖 1),利血平 (1號紙片)在不含小蘗堿的營養瓊脂平板 (B)中對無銅綠假單胞菌無抑制作用,在 1/4 M I C的小蘗堿營養瓊脂平板 (A)中能形成明顯的抑菌圈 (直徑 10.4 mm),說明利血平本身對該菌株無抗菌活性,但通過抑制細菌外排泵,提高了該菌株對小蘗堿的敏感性;編號為 2的樣本,在 A、B平板中均無抑菌圈,表明該樣本本身無抗菌活性,也不是外排泵抑制劑;編號為 3的樣本,在A、B平板中均形成抑菌圈,表明該樣本本身具有抗菌活性,不一定是細菌外排泵抑制劑;編號為 4的樣本,抑菌圈直徑 13 mm,和利血平結果一致,是細菌外排泵抑制劑。

圖 1 雙平板篩選細菌外排泵抑制劑Fig.1 Screening for bacterial efflux pump inhibitors by double plates

活性單體化合物(4號樣品)在甲醇中重結晶得針狀晶體,難溶于水,能溶于丙酮、乙醇、DMSO、甲醇等有機溶劑,熔點 297℃。1H NMR(Acetone)δ: 13.05(1H,s),9.71(1H,s),8.19(1H,s),8.55 (1H,s),7.46(2H,d,J=6.4 Hz),6.92(2H,d,J= 6.8 Hz),6.43(1H,d,J=2.4 Hz),6.28(1H,d,J= 2.4 Hz)。13C NMR(Acetone)δ:154.3(C-2),123.0 (C-3),181.6(C-4),159.0(C-5),99.8(C-6), 164.9(C-7),94.4(C-8),158.4(C-9),106.1(C-10),123.9(C-1′),131.1(C-2′,6′),115.9(C-3′, 5′),163.9(C-4′)。結合文獻[5],該化合物鑒定為4′,5,7-三羥基異黃酮 (4′,5,7-trihydroxyisoflavone),即金雀異黃酮(Genistein),結構見圖 2。

圖 2 4′,5,7-三羥基異黃酮Fig.2 4′,5,7-Trihydroxyisoflavone

4′,5,7-三羥基異黃酮能抑制細菌外排泵,提高細菌胞內小蘗堿的量,結果見圖 3。加入小蘗堿后,菌液相對熒光強度逐漸上升,4′,5,7-三羥基異黃酮在低濃度(64μg/mL)時對細菌外排泵已經具有明顯的抑制作用,增大濃度后,相對熒光單位進一步提高,存在明顯的量效關系。

圖 3 菌液相對熒光強度曲線Fig.3 Relative fluorescence units of cell

4 討論

近年來隨著對細菌耐藥機制研究的不斷深入,認識到細菌外排泵的超表達是耐藥性形成的主要原因之一,篩選發現新的細菌外排泵抑制劑 (EPIs,Efflux Pump Inhibitors)成為抗菌藥物研究的熱點。第一個被發現的 EPIs是來源于植物的生物堿利血平,因用量大時有神經毒性,故未能與抗菌藥物組成復合制劑,以后又從植物提取物中分離到一些 EPIs單體化合物,有的已經進入臨床試驗階段。在生態的選擇壓力下,植物可產生一些天然小分子對抗細菌外排泵,從植物中發現新的 EPIs的機會很大[6]。

為了對中藥提取物進行普篩,在吸取前人方法的基礎上,我們建立了雙平板對照篩選法,本法采用小蘗堿作為細菌外排泵底物,通過比較兩個平板含藥紙片周圍有無抑菌圈及抑菌圈的直徑大小,判斷篩選結果。方法簡便易行,成本低,適宜于對大批樣本進行快速篩選并在分離時進行活性跟蹤。

篩選發現某霉菌的提取物能抑制銅綠假單胞菌對小蘗堿的外排作用,經活性跟蹤分離、NMR鑒定,活性單體為 4′,5,7-三羥基異黃酮,實驗結果表明,該化合物提高了細菌細胞內小蘗堿的熒光強度。4′,5,7-三羥基異黃酮有多種生物學活性,同時也是腫瘤細胞 P-糖蛋白抑制劑,P-糖蛋白是腫瘤細胞的外排泵[7],可見該化合物是一種廣譜 EPIs。對 4′, 5,7-三羥基異黃酮進行結構改造,以提高抑制細菌外排泵的專屬性的研究工作正在進行之中。

1 WebberMA,Piddock LJV.The importance of efflux pumps in bacterial antibiotic resistance.Journal of Antinicrobial Chemotherapy,2003,51:9-11.

2 Lomovskaya O,Warren M,Lee A,et al.Identification and characterization of inhibitors of multidrug resistance efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa:novel agents for combination therapy.Ant im icrobial Agent and Chemotherapy,2001, 45:105-116.

3 StavriM,Piddock LJ,Gibbons S.Bacterial efflux pump inhibitors from natural sources.Journal of Antim icrobial Chemotherapy,2007,59:1247-1260.

4 Tegos G,Ster mitz FR,Lomovskaya O,et al.Multidrug pump inhibitors uncover remarkable activity of plant ant imicrobials.Antim icrobial Agent and Chem otherapy,2002,46:3133-3141.

5 Kozerski L,Kamien ski B,Kawe cki R,et al.Solution and solid state 13C NMR and X-ray studies of genistein complexeswith amines.Potential biological function of the C-7,C-5,and C-4-OH groups.O rg B iomol Chem,2003,1:3578-3585.

6 Markham PN.Inhibition of the emergence of ciprofloxacin resistance in Streptococcus pneumonide by the multidrug efflux inhibitor reserpine.Antim icrob Agents Chem other,1999,43: 988-989.

7 Castroa AF,Altenberg GA.Inhibition of drug transport by Genistein in multidrug-resistant cells expressing P-glycoprotein.B iochem ical Phar m acology,1997,53:89-93.

Screen ing for and Bioassay-guided Isolation of Bacterial Efflux Pump Inhibitors by ControlM ethod Based on Double Plates

YANG Zai-chang1＊,YANG Xiao-sheng2,N IU Yu-le11Chem ical Engineering College of Guizhou University,Guiyang 550003,China;2Key Laboratory of Chem istry forNatural Products of Guizhou Province and Chinese Academ y of Sciences,Guiyang 550004,China

To establish the method of screening for and bioassay-guided isolation of bacterial efflux pump inhibitors.Two plateswere prepared.One was nutrient agar plate and anotherwas also nutrient agar plate but contained berberine.The determination of the screening resultswasmade by the measurements of the diameters of the inhibition zone around the discs that to be pasted on the surface of the two plates and contained test samples.The method was reliable and steady. The extractof one kind of themould showed the activity to inhibit bacterial effluxpump.A monomeric compoundwaspurified by bioassay-guided isolation and identified as 4′,5,7-trihydroxyisoflavone by 1H and 13C ofNMR.The screening method for bacterial effluxpump inhibitorswas very simple and cheap forpractice.It is suitable forwho wanted to screen for bacterial efflux pump inhibitors from large quantities of samples.Also it is a good bioassay in isolation.

screening;bacterial efflux pump;inhibitors;double plates

1001-6880(2010)02-0277-04

2008-07-16 接受日期:2008-12-11

貴州大學博士啟動基金(No.X065008)

＊通訊作者 Tel:86-851-6848659;E-mail:yangzaichang@126.com

R285.5;Q58

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