雙水相體系萃取分離杜仲葉中桃葉珊瑚甙的研究

彭 勝,彭密軍,卜曉英,伍 鋼,胡文彬

吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室,張家界 427000

雙水相體系萃取分離杜仲葉中桃葉珊瑚甙的研究

彭 勝,彭密軍＊,卜曉英,伍 鋼,胡文彬

吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室,張家界 427000

建立了由高分子化合物聚乙二醇(PEG4000)與葡聚糖 40000(D40)形成的雙水相體系萃取分離杜仲葉中桃葉珊瑚甙的新方法。考察了萃取體系相圖,研究了 PEG4000/D40質量分數、樣品溶液加入量、pH值和溫度等因素對雙水相成相及桃葉珊瑚甙萃取率的影響。結果表明:PEG4000的質量分數為 11%,D40質量分數為8%、樣品溶液加入量為 8 g,溫度為 60℃,溶液 pH為 7時,雙水相體系對桃葉珊瑚甙有較高的萃取率,重復三次可達到 66.32%,而且萃取得到的桃葉珊瑚甙產品的純度達到 48.67%,遠遠高于粗提物中的 8.750%。

桃葉珊瑚甙;杜仲葉;雙水相體系;萃取;分離

杜仲 (Eucomm ia u lm oidesOliv)是中國特有的藥用物種。桃葉珊瑚甙是一種從杜仲葉和皮中分離出來的環烯醚萜糖甙,具有促進干細胞再生、明顯抑制乙肝病毒DNA復制,促進膠原蛋白的合成和抗肌肉骨骼老化等多種功效[1-3]。雙水相萃取 (aqueous two-phase extraction,ATPE)是利用物質在互不相溶的兩水相間分配系數的差異來進行萃取的方法。與傳統方法相比,具有如下優點:不存在有機溶劑殘留、分相時間短、能除去大量雜質和固體物質、易于工程放大和連續操作等,被廣泛應用于生物化學和生物化工、天然活性產物等領域[4-5]。國內外有將該體系用于天然活性成分的研究,但側重于如何提高目標產物萃取率,忽略了目標成分與雜質的分離[5-6]。針對這一情況,本文運用聚乙二醇 (PEG)/葡聚糖 40000(D40)體系,在保證分離效果的前提下,較系統地考察了杜仲葉中桃葉珊瑚甙的萃取情況,旨在為桃葉珊瑚甙的分離純化和開發利用提供新方法。

1 實驗部分

1.1 實驗原料及化學試劑

原料:杜仲葉于 2008年 9月采自吉首大學張家界校區后山(經吉首大學廖博儒研究員鑒定系杜仲科杜仲屬植物),50℃干燥,粉碎并過 40目篩,備用。桃葉珊瑚甙標準品購自日本和光純藥業公司。

試劑:分子量分別為 1000、2000、4000、6000的聚乙二醇(PEG)、葡聚糖 40000(D40)為化學純,Epstahl試劑[3]、醋酸、氫氧化鈉等均為國產分析純,實驗用水為超純水。

1.2 主要儀器

儀器:UV757CRT型紫外可見分光光度計(中國上海精密科學儀器有限公司);R215型旋轉蒸發儀(瑞士BUCH I);BM400型數顯電熱恒溫水浴鍋 (日本 YAMATO);KQ-250E型超聲波清洗器(中國昆山超聲儀器有限公司);AEG-220型電子天平 (日本SH IMADZU);LD5-2A型離心機 (北京醫用離心機廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 雙水相體系的制備

在刻度具塞離心管中加入適當的 PEG、D40和樣品溶液,使體系質量達到 10 g,溶解,形成雙水相體系。所得體系 PEG富集于上相,下相為 D40相。上相為深褐色,樣品溶液中部分桃葉珊瑚甙和絕大部分雜質均分布于此,下相呈亮黃色,部分黃酮類物質和桃葉珊瑚甙分布于此。離心分相,分別測定兩相中桃葉珊瑚甙含量,一次萃取完畢,補充 D40形成新的體系,重復下一次萃取,按下式計算[5]:

式中:R-相比;Vb-下相體積,mL;Vt-上相體積, mL;K-桃葉珊瑚甙的分配系數;Cb-下相桃葉珊瑚甙的質量濃度,mg/mL;Ct-上相桃葉珊瑚甙的質量濃度,mg/mL;Y-萃取率,%。

本研究的目的就是優化萃取條件,使得桃葉珊瑚甙盡可能轉移到下相,達到與色素及其他雜質的有效分離。

1.3.2 桃葉珊瑚甙的測定

用甲醇配制成 900μg/mL的桃葉珊瑚甙標準溶液,分別量取 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL標準溶液于 10 mL刻度試管中,分別加入 E試劑 1.7 mL,20%鹽酸 0.5 mL,95%的乙醇 2.5 mL,用水定容至 10 mL,在 75℃的條件下顯色 15 min,冷卻后,在分光光度計上,以試劑空白為參比于 601 nm處測定其吸光值,繪制曲線方程如下:Y=0.018+ 0.00468X,r=0.9995。式中 X為溶液中桃葉珊瑚甙質量濃度 (μg/mL);Y為吸光值,該方程在濃度為0.045-0.45μg/mL范圍內,Y與 X線性關系良好。

1.3.3 杜仲葉粗提液的制備

稱取 150 g杜仲葉粉,以 1∶6的料液比加入50%乙醇,于 50℃超聲波輔助提取 40 min,抽濾,收集濾液,濾渣重復提取一次,合并濾液,真空濃縮,離心,收集上清液(經測定為 1.105 g/mL),冷藏備用。取上清液如 1.3.2進行顯色測定,測得粗提液中桃葉珊瑚甙含量為 27.56 mg/mL。烘干后測定,粗提物中桃葉珊瑚甙的含量為 8.750%。

1.3.4 雙水相萃取條件的選擇

根據文獻及預試驗結果,采用高分子化合物PEG和 D40組成雙水相體系,對 PEG分子量、PEG4000/D40質量分數、樣品溶液加入量、pH值和溫度分別進行了考察。

2 結果與討論

2.1 PEG與 D40雙水相體系相圖[7]

將已知濃度的 PEG(分子量分別為 1000、2000、4000、6000)溶液逐滴加入 D40的濃溶液中,直至出現渾濁。記下此時的體系組成并向 D40溶液中加入 1 g水,搖勻待溶液變清后重復上述操作。將所記錄的體系組成以D40的質量百分含量為橫坐標,以 PEG的質量百分含量為縱坐標,得到雙節點曲線圖1。

由圖1可見,PEG的平均分子量越大,雙節線越趨向原點,成相的臨界濃度越低。因此在 PEG平均分子量 1000～4000之間,達到臨界濃度時,分子量為4000時消耗的 PEG和D40最少。而 PEG4000與PEG6000相比,前者 PEG和 D40的濃度范圍寬,有利于后續試驗的進行。而后者因 PEG分子量過大,使溶液黏度過高,不利于實驗進行。因此,選定PEG4000和D40構成本實驗的雙水相體系。

圖 1 PEG/D40雙水相體系相圖Fig.1 The phase diagram of PEG/D40 aqueous two-phase system

2.2 PEG4000和D40的質量分數對雙水相體系的影響

PEG4000和 D40的質量分數必須在相圖中雙節線上方,才能形成雙水相。靠近臨界點的系統,兩相形成較困難;遠離臨界點的系統,由于高聚物的質量分數較大,溶液黏度高,兩相分離時間過長,對分離也不利。因此 PEG4000和 D40的質量分數應適當選擇,既要易于形成合適的雙水相體系,又要保證兩相分離時間盡可能短[8],這樣才有利于目標物的萃取。

表 1 PEG4000和D40質量分數對雙水相體系的影響Table 1 Effectof the percentage of PEG4000 andD40 on the aqueous two-phase system

綜合文獻和相圖的結果,選定表 1中三組PEG4000/D40質量分數比進行試驗,各組分別加入2.5 g樣品溶液,以超純水補足 10 g,形成雙水相體系。第一組中 D40質量分數過大,消耗多,致使下相黏稠,取樣困難,而且萃取率升高不明顯。第三組中 PEG4000質量分數較大,而D40較少,使得R、K、Y均減小,結果也不理想。與第一、三組數據相比,第二組中 PEG4000和 D40質量分數比較適中,試劑消耗較少,且萃取率比較高。因此選定由 11% PEG4000和 8%D40組成雙水相體系進行下面研究。

2.3 樣品溶液加入量對雙水相體系的影響

在室溫下,向 11%PEG4000和 8%D40組成的雙水相體系中分別加入不同質量的樣品溶液,考察樣品加入量對體系的影響,結果見圖 2。

研究表明,雙水相萃取中單位質量相系統中樣品溶液的加入量是一個十分重要的參數。

圖 2 樣品溶液加入量對雙水相體系的影響Fig.2 The effect of leaching solution volume on the aqueous two-phase system

從圖 2可見,隨著樣品量的不斷增加,萃取率 Y值不斷增大,由 29%上升至 64.04%。從經濟角度考慮,在保證總質量為 10 g的前提下,除 PEG4000和D40外,其余全部用樣品溶液補足比較合適。

2.4 pH值對雙水相體系的影響

用質量分數分別為 11%的 PEG4000和 8%的D40制備雙水相體系,以樣品溶液補足 10 g,在室溫下,用醋酸和氫氧化鈉調節體系 pH值考察桃葉珊瑚甙的萃取率隨 pH值的變化情況,結果如圖 3所示。

圖 3 pH值對雙水相體系的影響Fig.3 The effect of pH value on the aqueous two-phase system

由圖可知,在 pH=5～9范圍內,Y值隨著 pH值的增大先增大后減小,在 pH為 7時達到最大。這主要是因為酸性條件不利于桃葉珊瑚甙的萃取;堿性較強時,上下相顏色均發生明顯改變,由原來的上相褐色和下相亮黃色,變為上相深綠色和下相綠色。推測可能是氫氧化鈉導致桃葉珊瑚甙分解。故確定雙水相體系以 pH值 7左右最佳。

2.5 溫度對雙水相體系的影響

溫度在雙水相分配中也是一個重要的參數,它主要影響相的高聚物組成。為此,在固定 pH為 7的條件下,考察了溫度對雙水相體系 (由 11% PEG4000和 8%D40組成)萃取桃葉珊瑚甙的影響,結果如圖4所示。

圖 4 溫度對雙水相體系的影響Fig.4 The effect of temperature on the aqueous twophase system

結果表明,隨著溫度的升高,相分離速度加快,而且溫度在 30～60℃區間內,萃取率上升迅速,溫度超過60℃后,萃取率略有下降。其原因可能是溫度過高,導致桃葉珊瑚甙分解;溫度過低,不利于傳質,故選定最適溫度為 60℃。

在以上確定的最佳 PEG/D40質量分數、樣品加入量、pH值、溫度等條件下,對目標物進行雙水相萃取試驗 3次,8 g(含桃葉珊瑚甙 199.53 mg)提取液中有 121.61 mg桃葉珊瑚甙被提取出來 (損失為8.01%),即得到下相對桃葉珊瑚甙的萃取率為66.32%,并且得到的桃葉珊瑚甙產品的純度達到48.67%,遠遠高于粗提物中桃葉珊瑚甙的含量8.750%。

3 結論

綜上所述,雙水相萃取分離杜仲葉桃葉珊瑚甙的最佳體系是:由質量分數為 11%PEG4000和 8% D40組成,最佳萃取條件是樣品溶液 8 g,pH值 =7,溫度 60℃。本方法為環烯醚萜類化合物萃取分離提供了一種有效方法,使桃葉珊瑚甙與樣品溶液中其他物質得到有效分離,D40相萃取率達到 66. 32%以上,桃葉珊瑚甙純度也由粗提物中的 8. 750%提高到 48.67%。該方法具有分相時間短、除雜能力強,分離過程更經濟、不存在溶劑殘留、萃取率高,可連續操作、安全方便等優點。

1 Kim DH,K im BR,Kim JY,et al.Mechanism of covalent adduct formation of aucubin to proteins.Toxicol Lett,2000, 114:181-188.

2 Chang I.Inhibition of HBV replication by aucubin.Photother Res,1997,11(3):189-192.

3 Peng MJ(彭密軍),Zhou CS(周春山),Liu JL(劉建蘭),et al.Study on optimizing the analysis condition for active compound inEucomm iaOlive.Spectrosc Spectr Ana(光譜學與光譜分析),2004,24:1655-1658.

4 LiMQ(李夢青),Geng YH(耿艷輝),Liu G M(劉桂敏),et al.Application of aqueous two phase extraction technique in separation and purification of resveratrol.Nat Prod Res Dev (天然產物研究與開發),2006,18:647-649.

5 Zhao AL(趙愛麗),Chen XQ(陳曉青),Jiang XY(蔣新宇).The separation of baicalin by aqueous two-phase extraction system.Chin Tradit PatM ed(中成藥),2008,30:498-501.

6 Huo Q(霍清),Wang Q(王強).Separation of chlorogenic acid with aqueous two-phase systems containing acetone and dipotassium hydrogen phosphate.Food Sci(食品科學), 2008,29:234-236.

7 Xu HD(徐懷德).Technology of Extraction from Natural Products(天然產物提取工藝學),Beijing:China Light Industry Press,2006:191.

8 Li XL(李夏蘭),Cai EN(蔡婀娜),Chen PQ(陳培欽). Extracting laminaran polysaccharides by PEG/(NH4)2SO4aqueous two-phase system.J Huaqiao Univ,Nat Sci(華僑大學學報,自科版),1999,20:84-88.

Extraction and Separation of Aucubin from the Leave of Eucomm ia ulm oidesin Aqueous Two-phase System

PENG Sheng,PENGMi-jun＊,BU Xiao-ying,WU Gang,HU Wen-bing
Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chem ical Industry Engineering,Jishou University,Zhangjiajie 427000,China

A new method to extract and separate aucubin from the leave ofEucomm ia u lm oidesOliv.in aqueous twophase system formed by macromolecular compound PEG4000 and dextran 40000 was investigated.The effect of phase map of extraction system,the addition amount of sample solution,pH and temperature were investigated systematically. The results showed that the bestATPSwas composed of 11%PEG4000 and 8%D40,and addition of sample was 8 g at 60℃,pH 7.The highest extraction rate could reach to 66.32%after three times.The content of aucubin in the extract from liquid of aqueous two-phase extraction could rise up to 48.67%from 8.750%.

aucubin;leave ofEucomm ia ulm oidesOliv.;aqueous two-phase system;extraction;separation

1001-6880(2010)02-0264-04

2009-06-03 接受日期:2009-10-27

湖南省教育廳重點項目 (08A056);張家界市科技局項目(2008);吉首大學研究生科研創新項目(JGY200907)

＊通訊作者 Tel:86-0744-6313787;E-mail:pengmj163@163.com

R284.2

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