山藥糖蛋白的提取及純化研究

邵 海,龔鋼明,管世敏

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 200090;2上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 200235; 3上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234

山藥糖蛋白的提取及純化研究

邵 海1,2,龔鋼明2＊,管世敏3

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 200090;2上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 200235;3上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234

采用正交試驗(yàn)得出了提取山藥糖蛋白的優(yōu)化試驗(yàn)條件,即提取溫度 40℃、提取時間 2 h、料液比 1:50。山藥經(jīng)水浸提分離、浸提液脫蛋白、透析、乙醇沉淀物經(jīng)DEAE-52及 Sephadex G-75柱層析得到兩種糖蛋白組分GLP-Ⅰ和 GLP-Ⅱ,經(jīng) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,相對分子量分別是 13000和 38000。

山藥;糖蛋白;正交試驗(yàn);純化

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥 (河南懷山藥,D ioscorea oppositaThunb.購于上海雷允上藥店);透析袋(美國 Sigma公司,分子截量 10000 Da);DEAE-52(英國 Whatman公司); Sephadex G-75(瑞典 Pharmacia公司);低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(上海升正生物技術(shù)有限公司);牛血清白蛋白(上海昱民生物技術(shù)有限公司);其它試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)(UV-2000,尤尼柯儀器有限公司);電泳儀(DYY-2C,北京六一儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (R201,上海申勝生物技術(shù)有限公司);自動部分收集器(DBS-160F,上海精科實(shí)業(yè)有限公司);高速組織搗碎機(jī)(DS-1,上海標(biāo)本模型廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 山藥糖蛋白的分離純化

稱取一定量的懷山藥片,加適量水,組織搗碎機(jī)粉碎后,在熱水浴中浸提,離心,收集上清液,減壓濃縮。加入氯仿:正丁醇 =4∶1(V/V)的 Sevage試劑,以充分去除脂質(zhì)、游離蛋白質(zhì),然后樣液取水層透析,收集透析袋內(nèi)液,離心,上清液即是山藥糖蛋白粗品液,粗品液依次經(jīng) DEAE-52柱層析 (Φ1.0 cm ×20 cm),去離子水、0.05 mol/L氯化鈉、0.1 mol/L氯化鈉溶液階段洗脫;Sephadex G-75柱層析 (Φ1.0 cm×40 cm),去離子水洗脫,逐管采用在 280 nm下和硫酸-苯酚法在 490 nm下檢測其吸光度,并分別繪制曲線,取兩個曲線峰重疊的管,可得到純品山藥糖蛋白。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

系統(tǒng)基于激光測徑儀的掃描測徑技術(shù)，可以直接測得小直徑( 處于激光測徑儀量程內(nèi))塞規(guī)的尺寸。通過一套專用夾具控制塞規(guī)的移動和旋轉(zhuǎn)，可實(shí)現(xiàn)其直線度和圓度的快速綜合測量。對于大直徑(超出激光測徑儀量程)的塞規(guī)，輔以激光二維掃描傳感器獲取標(biāo)準(zhǔn)件和待測件的輪廓信息，通過比較測量獲取塞規(guī)直徑。本系統(tǒng)以嵌入式控制單元為核心實(shí)現(xiàn)對各個測量模塊控制，并對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析和評定。系統(tǒng)的組成框圖如圖1所示。

以粗糖蛋白為考察指標(biāo),用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選山藥糖蛋白最佳提取工藝。由水浴溫度、提取時間和料液比為影響因素,設(shè)置 3個水平,實(shí)驗(yàn)安排見表1。

表 1 因素水平表Table 1 Table of factors and levels

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.3.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[2]

精確稱取分析純恒重葡萄糖 10 mg,加水溶解后定容至 250 mL,配制成 40μg/mL。取 16支試管分成 8組,分別加入標(biāo)準(zhǔn)糖溶液 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及 1.8 mL,各以水補(bǔ)足至 2.0 mL,然后加入 5%苯酚 1 mL,搖勻,加濃硫酸 5.0 mL,搖勻,室溫放置 20 min,490 nm比色測吸光值。以 2.0 mL去離子水同上操作作為空白。以糖含量 C為橫坐標(biāo),吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:A=0.0129C-0.0051,r=0.9967。線性范圍:8～36μg/mL。

1.3.3.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線[2]

精確稱取牛血清白蛋白 100 mg,加水溶解后定容至 100 mL,配制成 1 mg/mL。取 16支試管分成 8組,分別加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5及 4.0 mL,各以水補(bǔ)足至 4.0 mL,搖勻, 280 nm測吸光值。以 4.0 mL去離子水同上操作作為空白。以蛋白含量 C為橫坐標(biāo),吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:A=0.00064C-0.0008,r=0.9999。線性范圍:125～1000μg/mL。

1.3.4 純度鑒定及分子量測定

采用 SDS-PAGE電泳,分離膠濃度 14%,Tris-甘氨酸電極緩沖液,水∶甲醇∶乙酸 (5∶5∶1)的 0.05 %考馬斯亮藍(lán) R250染色液,水∶甲醇∶乙酸 (35∶2∶ 3)的脫色液,采用低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn),溴酚藍(lán)為指示劑,以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率 u為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù) lg Mr為縱坐標(biāo),根據(jù)糖蛋白的遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取分子量[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

見表 2,3。方差分析的結(jié)果表明:以粗糖蛋白為指標(biāo),對山藥糖蛋白得率影響因素的順序?yàn)锳>C >B,確定最優(yōu)工藝為提取溫度 40℃、提取時間 2 h、料液比 1∶50。

表 2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 L9(34)The design and results of orthogonal experiment

表 3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.2 純化

過DEAE-52和 Sephadex G-75層析柱的流速均為0.4 mL/min。經(jīng)DEAE-52層析柱的洗脫液,依次是去離子水 (1～34管)、0.05 mol/L NaCl(35～55管)、0.1 mol/L NaCl(56～80管),洗脫曲線見圖 1。經(jīng) Sephadex G-75層析柱的洗脫液是去離子水,洗脫曲線見圖2。

2.3 純度鑒定及分子量測定

2種山藥糖蛋白 SDS-PAGE電泳圖譜為兩條帶,說明 2種糖蛋白為電泳純,見圖 3。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率 u為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù) lg Mr為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程: lgM r=-1.653u+5.4512,r=0.9919。

GLP-Ⅰ的遷移率為 0.8091,GLP-Ⅱ的遷移率為0.5273,由蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知 GLP-Ⅰ的分子量為13000 Da,GLP-Ⅱ的分子量為 38000 Da。GLP-Ⅰ的糖含量為 13.88%,蛋白質(zhì)含量為 86.12%;GLP-Ⅱ的糖含量為 15.36%,蛋白質(zhì)含量為 84.64%。

圖 3 糖蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.3 The SDS-PAGE photograph of GLP

3 結(jié)論

本文通過正交實(shí)驗(yàn)得出提取山藥糖蛋白的優(yōu)化工藝條件,粗糖蛋白經(jīng)DEAE-52柱層析和 Sephadex G-75柱層析分離純化后,得到純度很高的山藥糖蛋白。該流程能有效地純化山藥糖蛋白,具有產(chǎn)物純度高、方法簡便、收率高等優(yōu)點(diǎn),為我國資源豐富的山藥找到了一條深加工途徑。

1 Sun C(孫冊),Mo HQ(莫汗慶).The Structure,Function andMetabolism of Glycoprotein and Proteoglycan(糖蛋白與蛋白聚糖結(jié)構(gòu)、功能和代謝),1stEd.Beijing:Science Press,1998.

2 Yu RY(余瑞元),Chen LT(陳來同),Yuan MX(袁明秀),et al.The Principle andMethod of Biochemical Experiment(生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法),2stEd.Beijing:Peking University Press,2005.

3 Tian YP(田亞平).The Biochemical Separation Technology (生化分離技術(shù)),1stEd.Beijing:Chemical Industry Press, 2006.217.

Study on Extraction and Purification of Glycoprotein from Chinese Yam

SHAO Hai1,2,GONG Gang-ming2＊,GUAN Shi-min31College of Food Science and Technology,ShanghaiOcean University,Shanghai 200090,China;
2School of Perfume and A rom a Technology,Shanghai Institute of Technology,Shanghai 200235,China;3College of Life and Environm ent Sciences,Shanghai Nor m al University,Shanghai 200234,China

Utilizing orthogonal testof the extraction of glycoprotein from Chinese yam,this article put forward an optimum extracting condition as follows:extracting temperature was 40℃,extracting t ime was 2 h,material-water ratio was 1:50. Two glycoproteins named GLP-Ⅰand GLP-Ⅱwere isolated from Chinese yam with water extraction,Sevage deprotein, dialysis,alcohol sedimentation,DEAE-52 and Sephadex G-75 column chromatography.Their average molecular weight were 13000 Da and 38000 Da with SDS-PAGE.

Chinese yam;glycoprotein;orthogonal exper iment;purification

1001-6880(2010)02-0261-03

2008-06-16 接受日期:2008-08-19

＊通訊作者 Tel:86-21-64941789;E-mail:kkming512@yahoo.com.cn

R284.2;Q949.71+8.27

A