香菇蛋白的分級純化和結構分析

李 波,蘆 菲,田 燕,趙 森

河南科技學院食品學院,新鄉 453003

香菇蛋白的分級純化和結構分析

李 波＊,蘆 菲,田 燕,趙 森

河南科技學院食品學院,新鄉 453003

香菇粉經 10℃pH 10的水提取制備香菇蛋白,得率 13.1%,其蛋白含量 47.5%,多糖含量 24.2%。香菇蛋白經DEAE Sepharose CL-6B柱層析分級得 5個級分,收集級分 F1、F2、F3、F4,它們都是由蛋白和多糖構成的復合物。Sepharose CL-6B凝膠色譜顯示,F2和 F4的分子量分布較為均勻,且以蛋白為主,多糖含量很低;F3主要由兩個分子量不同的蛋白級分構成,含有一定的多糖;F1中多糖含量較高,蛋白含量較少,且多糖分子量分布均勻。香菇蛋白的分子量主要集中在 20 kDa～40 kDa之間。F1、F3、F4都屬于酸性蛋白質,含有除色氨酸之外的 7種必需氨基酸,除蛋氨酸含量較低外,其余必需氨基酸含量接近,且賴氨酸含量較高。紅外光譜分析表明,香菇蛋白的二級結構主要為α-螺旋和無規卷曲。

香菇;蛋白;分級;結構

香菇 (Lentinus edodes)是我國的特色食用菌,產量居世界第一位。香菇富含多種營養保健成分[1],目前國內外對香菇多糖的研究報道較多[2],而對香菇中其他功能成分的研究開發很少。根據我們的分析結果,香菇干粉的蛋白含量為 21.8%(凱氏定氮法)。如果在提取香菇多糖的同時,能夠將蛋白等功能成分一并提取出來,則能充分利用香菇原料資源,提高產品的附加值,促進香菇產業的快速發展。

本文利用香菇蛋白與多糖溶解性的差異,先將蛋白提取出來,殘余物用于提取多糖。對提取出的香菇蛋白,采用離子交換和凝膠過濾柱層析進行了分級純化,并對各級分的分子量、氨基酸組成和紅外光譜進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮香菇(申香 5號)購自新鄉市李莊村香菇生產基地,經干燥、粉碎后備用。

Agilent 1100氨基酸自動分析儀,Bruker TENSOR-27傅立葉變換紅外光譜儀,尤尼柯 7200可見分光光度計。柱層析系統(梯度混合儀、恒流泵、紫外檢測器、自動收集器、記錄儀)為上海滬西分析儀器廠產品。DEAE Sepharose CL-6B和 Sepharose CL-6B(GE Healthcare Bio-Sciences AB公司)。透析袋(8000～12000,寶信生物科技有限公司)。所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 香菇蛋白的提取

取 100 g香菇粉,加 pH 10的水 1000 mL,在 10℃提取 30 min,離心分離 (3000 r/min,15 min),收集上清液(沉淀可用于提取香菇多糖)。上清液減壓濃縮后,加乙醇至 83%乙醇濃度,4℃放置過夜。離心分離,沉淀依次用乙醇、丙酮洗滌沉淀后,于40℃烘干,得香菇蛋白。

1.2.2 香菇蛋白的分級純化

取 0.5 g香菇蛋白,用50 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7,0.02 mol/L)溶解后,離心 (4000 r/min,20 min),取上清液,經 DEAE Sepharose CL-6B柱 (2.6×20 cm)層析,用磷酸鹽緩沖液 (pH 7,0.02 mol/L)洗脫出第一個級分后,進行 0.2～1.0 mol/L NaCl-磷酸緩沖液 400 mL線性梯度洗脫,最后用 2 mol/L NaCl-磷酸緩沖液 200 mL進行洗脫。洗脫液流速為1 mL/min,每管收集 9 mL。以苯酚-硫酸法檢測多糖 (490 nm)[3],紫外 280 nm檢測蛋白。

洗脫液透析脫鹽濃縮后,冷凍干燥,得離子交換各級分。各級分用磷酸鹽緩沖液溶解后,經 Sepharose CL-6B柱 (1.6×100 cm)層析,用 0.1 mol/L的NaCl-磷酸緩沖液 (pH 7,0.02 mol/L)洗脫。洗脫液流速為 15 mL/h,每管收集 4 mL。

1.2.3 分子量測定

Sepharose CL-6B柱(1.6×100cm)層析方法,用已知分子量的標準蛋白制作標準曲線,0.1 mol/L的NaCl-磷酸緩沖液(pH 7,0.02 mol/L)洗脫。

1.2.4 氨基酸組成分析

樣品經 6 mol/L鹽酸在 110℃水解 24 h,用氨基酸自動分析儀測定。

1.2.5 紅外光譜分析

采用KBr壓片法。

1.2.6 蛋白含量測定

香菇蛋白中的蛋白質含量測定采用凱氏定氮法。

2 結果與討論

2.1 香菇蛋白的提取

100 g香菇粉經提取制備,可得香菇蛋白 13.1 g,其蛋白含量為 47.5%,多糖含量為 24.2%。同時,可得到香菇多糖 5.6 g,其多糖含量為 69.5%,蛋白含量為 18.3%。

2.2 香菇蛋白的分級純化

香菇蛋白溶解后,用陰離子交換色譜 DEAE Sepharose CL-6B進行分級。樣品經磷酸鹽緩沖液洗脫出級分 F1,然后經 0.2～1.0 mol/L NaCl線性梯度洗脫出級分 F2、F3、F4,最后經 2 mol/L NaCl洗脫出級分 F5(圖 1)。由于 F5含量很少,所以僅收集了 F1、F2、F3、F4這四個級分。由圖可看出,在蛋白出峰的位置也存在多糖的峰,表明這四個級分的蛋白和多糖是以結合形式存在的,這可能也是香菇蛋白中含有 24%多糖的原因之一。F1多糖含量較高,F4蛋白含量較高。

圖 1 香菇蛋白的DEAE Sepharose CL-6B柱層析Fig.1 Chromatogram of PLE on a DEAE Sepharose CL-6B column

圖 2 級分 F1～F4的 Sepharose CL-6B柱層析Fig.2 Chromatogram of fractions F1-F4 on a Sepharose CL-6B column

凝膠過濾色譜可根據蛋白分子的大小和形狀不同而將其進行分離。級分 F1-F4的 Sepharose CL-6B柱色譜(圖 2)顯示,F4和 F2的分子量分布較為均勻,且以蛋白為主,多糖含量很低;F3主要由兩個分子量不同的蛋白級分構成,含有一定的多糖;F1中多糖含量很高,而蛋白含量較少,且多糖分子量分布均勻。

2.3 不同級分的分子量

經 Sepharose CL-6B凝膠柱層析測定,F1的分子量為 26515 Da,F2為 22683 Da,F3為 42355和322329 Da,F4為 30996 Da。結果顯示,香菇蛋白的分子量主要集中在 20～40 kDa之間,另有 1級分分子量較大,超過 300 kDa。

2.4 不同級分的氨基酸組成

表 1顯示,三種級分中天冬氨酸和谷氨酸含量較高,它們屬于酸性氨基酸。二者之和與賴氨酸、精氨酸、組氨酸 (均為堿性氨基酸)之和的比值分別為:F1=1.664,F3=2.587,F4=3.474。因此,三種級分都屬于酸性蛋白質,且在pH 7時蛋白質所帶負電荷的大小為 F4>F3>F1,所以在陰離子交換柱層析時 F1最先被洗脫出來,F4最后被洗脫出來。三種級分中絲氨酸和蘇氨酸含量較高,二者易與糖鏈形成O-糖苷鍵的連接,這可能是香菇蛋白中結合有較多糖鏈的一個原因。三種級分含有除色氨酸之外的 7種必需氨基酸,除蛋氨酸含量較低外,其余必需氨基酸含量接近,且賴氨酸含量較高,而賴氨酸是大米、小麥等谷物食品的第一限制氨基酸。因此香菇蛋白對平衡膳食中的氨基酸比例具有重要意義。

2.5 不同級分的紅外光譜

蛋白質在紅外區有若干特征吸收帶,其中酰胺I帶 (1600～1700 cm-1)的譜峰指認目前比較成熟, 1650～1658 cm-1為α-螺旋,1610～1640 cm-1為β-折疊,1660～1700 cm-1為β-轉角,1640～1650 cm-1為無規卷曲[4,5]。香菇蛋白的紅外光譜 (圖 3)在酰胺I帶呈現很強的吸收峰,各級分在酰胺 I帶的譜峰為:F1—1656、1648、1642 cm-1;F2—1657、1649、1641 cm-1;F3—1650 cm-1;F4—1659、1653、1647 cm-1。據此分析,F1的二級結構為α-螺旋和無規卷曲,且后者比例稍多;F2與 F1類似;F3只有一個 1650 cm-1峰,恰恰位于α-螺旋與無規卷曲的交界處,暗示 F3的二級結構可能比較均一;F4也存在α-螺旋和無規卷曲,且前者比例稍多。

表 1 級分 F1、F3、F4的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of F1,F3 and F4

圖 3 香菇蛋白各級分的紅外光譜Fig.3 I R spectra of PLE fractions

3 結論

100 g香菇粉經 10℃pH 10的水提取,可得香菇蛋白 13.1 g,其蛋白含量為 47.5%,多糖含量為24.2%。香菇蛋白經 DEAE Sepharose CL-6B柱層析分級,可得 5個級分。收集級分 F1、F2、F3、F4,它們都是由蛋白和多糖構成的復合物,蛋白和多糖之間存在較強的結合作用力。

Sepharose CL-6B凝膠色譜顯示,F4和 F2的分子量分布較為均勻,且以蛋白為主,多糖含量很低; F3主要由兩個分子量不同的蛋白級分構成,含有一定的多糖;F1中多糖含量較高,蛋白含量較少,且多糖分子量分布均勻。香菇蛋白的分子量主要集中在20～40 kDa之間,另有 1級分分子量較大,超過 300 kDa。

級分 F1、F3、F4都屬于酸性蛋白質,天冬氨酸和谷氨酸含量較高。三種級分含有除色氨酸之外的7種必需氨基酸,除蛋氨酸含量較低外,其余必需氨基酸含量接近,且賴氨酸含量較高。紅外光譜分析表明,香菇蛋白的二級結構主要為α-螺旋和無規卷曲。

1 Zhang RG(張潤光),Su DH(蘇東華),Zhang XC(張小翠).Nutritional functions and products developmentofLentinus edodes.Food Res Dev(食品研究與開發),2004(4): 125-128.

2 Luo W(羅煒),Li D(李東).Research advances inLentinan.Food Fer men Indus(食品與發酵工業),2000,26(4): 63-67.

3 ZhangWJ(張惟杰).Biochemistry Technology of Glycoconjugates(糖復合物生化研究技術).Hangzhou:Zhejiang U-niversity Press,1999.11-12.

4 Ge ZC(戈志成),Zhang YP(張燕萍).Studying the secondary structure ofmodified gluten by FTIR.J Chin Cereals and O ils Association(中國糧油學報),2006,21(3):36-38.

5 Zhou W(周文),Chen X(陳新),Shao ZZ(邵正中).Conformation studies of silk proteins with infrared and raman spectroscopy.Progress in Chem(化學進展),2006,18:1514-1522.

Fractionation and Structure of Protein fromLentinus edodes

L IBo＊,LU Fei,T IAN Yan,ZHAO Sen
School of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China

Powder ofLentinus edodeswas treated with water of 10℃and pH 10 to extract the protein ofLentinus edodes (PLE).The yield of PLE was 13.1%,and its protein contentwas 47.5%and polysaccharide contentwas 24.2%.PLE was graded into five fractions by chromatography on a DEAE Sepharose CL-6B Column.Fractions F1,F2,F3 and F4 were collected,which allwere the complex of protein and polysaccharide.Gel filtration chromatography of Sepharose CL-6B showed thatmolecularweight(Mw)distribution of F2 and F4 was symmetrical,and they contained mainly protein and little polysaccharide.F3 was composed of two protein fractions with differentMw and contained some polysaccharide.F1 contained more polysaccharide and less protein and itsMw distribution was symmetrical.Mw of PLE wasmainly between 20-40 kDa.F1,F2 and F3 were belonged to acidic proteins.They contained seven kindsof essential amino acids except Trp.Besides ofMetwith less content,other amino acids had a lmost content and the contentofLyswas higher.I R spectra showed that secondary structure of PLE mainlywasα-helix and random coil.

Lentinus edodes;protein;fractionation;structure

1001-6880(2010)02-0257-04

2008-07-23 接受日期:2008-10-14

河南省高校新世紀優秀人才支持計劃項目(2006HANCET-17);河南科技學院重點科研項目

＊通訊作者 Tel:86-373-3040977;E-mail:libowuxi@yahoo.com.cn

Q946.1;R284.1

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