N-CWS灌胃對小鼠移植性腫瘤及免疫功能的影響

張祝蘭,唐文力,楊煌建,王 娟,洪金基

福建省微生物研究所,福州 350007

N-CWS灌胃對小鼠移植性腫瘤及免疫功能的影響

張祝蘭＊,唐文力,楊煌建,王 娟,洪金基

福建省微生物研究所,福州 350007

為了考察紅色諾卡氏菌細胞壁骨架(Nocardia rubracellwall skeleton,N-CWS)灌胃給藥對小鼠的體內(nèi)抑瘤效應及其免疫調(diào)節(jié)作用,采用小鼠肉瘤 S180的移植性腫瘤模型,檢測 N-CWS灌胃給藥的抑瘤活性;同時觀察N-CWS體內(nèi)細胞毒作用和對正常小鼠的毒性、免疫器官重量、巨噬細胞 (MΦ)吞噬功能及脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響。結果顯示,小鼠灌服N-CWS的 LD50>1.2 g/kg;N-CWS 200、400、800 mg/kg劑量灌胃小鼠對 S180有明顯的抑制作用,其抑瘤率分別為 63.33%、71.11%、64.88%;與對照組比較,N-CWS可增加免疫器官重量和提升外周血白細胞數(shù)量、能明顯提高小鼠MΦ的吞噬活性及顯著提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率(P<0.05),同時N-CWS激活了的MΦ對腫瘤細胞的細胞毒效應亦明顯增強(P<0.05)。因此N-CWS適用于口服給藥,對小鼠移植性腫瘤有明顯的抑制作用,其抗腫瘤作用可能與增強機體免疫功能有關。

紅色諾卡氏菌細胞壁骨架;抗腫瘤;免疫調(diào)節(jié);給藥途徑

N ocardia rubra為諾卡氏菌屬 (N ocardiofor m actinom ycetes)的紅色諾卡氏菌,其細胞壁 (N-CWS)由諾卡氏菌酸、阿拉伯半乳聚糖和粘肽等組成[1]。Azuma等于 1976和 1978年相繼報道了 N ocardia rubra細胞壁骨架 (N-CWS)注射給藥的抗癌免疫佐劑活性[2,3]。研究表明,N-CWS適用于各種腫瘤引起的胸腹水的控制,肺癌、晚期胃癌和食道癌等的輔助治療[4],但臨床上注射給藥可能出現(xiàn)局部皮膚紅腫結節(jié),潰瘍,部分患者有發(fā)熱反應等副作用[5],影響患者的繼續(xù)治療。本研究對小鼠灌胃給藥 NCWS,考察其體內(nèi)細胞毒作用和對小鼠的毒性、免疫活性及對小鼠移植性腫瘤的抑瘤效應等生物活性,并初步探討其作用機理,旨在為其尋找最佳的給藥途徑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與主要試劑

N-CWS(本所提供),ConA (SIG MA),MTT (SIG MA),DMSO為 AR,RPM I1640(G IBCO),中性紅(上海試劑三廠)。

1.1.2 動物

ICR小白鼠(購自福建醫(yī)科大學動物實驗中心,雌雄各半,體重 18 g～22 g)。

1.1.3 瘤株

肉瘤 S180及艾氏腹水瘤 EAC(購自中國科學院上海藥物所,福建醫(yī)科所傳代保種)。

1.1.4 儀器

雙目顯微鏡 (OLY MPUS),XDS-1倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠),酶標儀 (日本 B ID-RAD 550), CO2培養(yǎng)箱 (美國 Cole Parmer)。

1.2 方法

1.2.1 毒性試驗

采用最大給藥量法,20只小鼠,雌雄各半,體重18～22 g,給予N-CWS 30 mg/mL,每只小鼠灌胃 0. 80 mL,連續(xù) 14天觀察小鼠出現(xiàn)的反應。

1.2.2 對小鼠移植性腫瘤的抑瘤試驗

抽取生長 7d的 S180小鼠腹水調(diào)整成 5×106細胞/mL的懸液,小鼠右腋皮下接種 0.2 mL/只,接種次日開始給藥。給藥方法:試驗組按不同劑量 (NCWS 200、400、800 mg/kg)每日定時灌胃給藥 0.5 mL/只,連續(xù) 15 d。對照組灌胃等量生理鹽水。停藥次日解剖,取瘤稱重,計算腫瘤生長抑制率。

1.2.3 體內(nèi)細胞毒試驗—W inn Test

小鼠灌胃給藥方法同 1.2.2。停藥次日處死小白鼠,無菌采取腹腔液,離心洗滌,鏡檢計數(shù),活性在95%以上,調(diào)整巨噬細胞的濃度為 5×107/mL。將 5 ×107/mL MΦ懸液與艾氏腹水瘤 (EAC)細胞懸液(1×108細胞/mL)等量混合,取 0.2 mL接種至小鼠右腋皮下,第 14 d解剖,稱瘤重。

1.2.4 免疫器官影響試驗

小鼠灌胃給藥方法同 1.2.2,停藥次日眼眶采血,行外周白細胞計數(shù),處死小白鼠,分別取出胸腺、脾臟并稱重。

1.2.5 巨噬細胞(Macrophage,MΦ)功能影響試驗

小鼠灌胃給藥和制備 MΦ懸液方法分別同1.2.2和 1.2.3,調(diào)節(jié)懸液的MΦ濃度為 2×106/ mL。于 96孔培養(yǎng)板中每孔加 100μL,置 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 h,棄上清液,洗滌,加入一定量的0.075%中性紅溶液,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1 h。取出培養(yǎng)板,棄中性紅,清洗,加入細胞裂解液150μL。靜置過夜,測定 570 nm的吸光值 A570,A值表示巨噬細胞吞噬功能的強弱。

1.2.6 淋巴細胞轉(zhuǎn)化影響試驗

無菌取脾制單個細胞懸液,離心收集細胞,Tris-NH4Cl緩沖液溶解紅細胞后離心洗滌,將細胞重懸于完全培養(yǎng)液。取一定濃度的懸液接種于 96孔板中(100μL/孔),同時加入一定量的N-CWS,設立 3復孔,另設培養(yǎng)液空白對照孔,細胞生長對照孔及Con A陽性對照孔,總量為 200μL/孔。于 5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中 37℃培養(yǎng) 72 h。每孔加入 15 μL MTT,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,加入 100μL DMSO,測定波長為 570 nm處的吸光度 A570,計算淋巴細胞轉(zhuǎn)化增強率。

2 結果

2.1 N-CWS的毒性

N-CWS樣品以最大給藥量給藥,未見小鼠有任何異常,繼續(xù)觀察 14 d,小鼠未見任何毒性反應,結果表明口服N-CWSLD50>1.2 g/kg,提示N-CWS口服給藥毒性低。

2.2 N-CWS的抑瘤作用

接種 S180次日開始連續(xù)灌胃給藥 15 d進行治療試驗,結果見表 1。與對照組比較,治療給藥低劑量、中劑量和高劑量組對小鼠 S180的抑瘤率分別為63.33%、71.11%、64.88%,表明 N-CWS口服給藥對 S180腹水型轉(zhuǎn)實體瘤具有顯著的治療作用。

表 1 N-CWS對小鼠 S180的抑瘤作用Table 1 Effects of N-CWS on suppression of tumor growth of S180in mice

2.3 N-CWS的細胞毒作用

考察試驗組和對照組 (巨噬細胞∶瘤細胞效靶比 =1∶2)的體內(nèi)殺傷腫瘤細胞的功能,結果見表2,與對照組比較,試驗低劑量組、中劑量組和高劑量組的瘤重均明顯低于對照組,表明N-CWS口服給藥具有提高對腫瘤細胞的細胞毒作用。說明 N-CWS活化的巨噬細胞明顯增強抗瘤活性,提示其抗腫瘤過程中的非特異性免疫促進作用。

表 2 N-CWS對巨噬細胞抑瘤活性的影響Table 2 Inhibitory effects of N-CWS on the growth of EAC in vivo

2.4 N-CWS對免疫器官的影響

通過灌胃給藥N-CWS免疫小鼠,采血,白細胞計數(shù),并取出胸腺脾臟稱重,結果見表 3。與對照組比較,低劑量組顯著提高白細胞數(shù)量 (P<0.05),中劑量組顯著提高白細胞數(shù)量和小鼠胸腺明顯增重(P<0.05),高劑量組顯著提高白細胞數(shù)量和小鼠胸腺脾臟均明顯增重 (P<0.05),表明適當劑量的N-CWS明顯增加胸腺脾臟重量和提升白細胞數(shù)量。提示N-CWS對小鼠免疫系統(tǒng)具有明顯的刺激作用。

表3 N-CWS對小鼠免疫器官的影響Table 3 Effects ofN-CWS on immune organs ofmice

2.5 N-CWS對MΦ吞噬功能的影響

N-CWS連續(xù)定時灌胃給藥 15 d,停藥次日測定小鼠的MΦ吞噬中性紅的作用,結果見表 4。與對照組比較,N-CWS低、中劑量組均具有明顯地提高小鼠MΦ吞噬中性紅的作用 (P<0.05),而高劑量組非常顯著地提高小鼠MΦ吞噬中性紅的作用 (P <0.01),說明N-CWS在一定劑量下具有明顯的激活小鼠腹腔MΦ和機體應激能力,其激活小鼠腹腔MΦ和機體應激能力及提高機體免疫功能與劑量呈正相關。說明N-CWS口服給藥具有提高小鼠MΦ的吞噬活性的功能。

表 4 N-CWS對小鼠巨噬細胞吞噬中性紅的影響Table 4 Effects ofN-CWS on murine peritonealMΦphagocytic neutral red

2.6 N-CWS對淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能的影響

無菌制備濃度為 1×107/mL小鼠脾 T淋巴細胞懸液,于 96孔板中每孔加入 100μL懸液,同時加一定量的N-CWS,于 5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng),采用MTT法測定波長為 570 nm處的吸光度,結果N-CWS組與Con A陽性對照組均明顯提高小鼠脾淋巴細胞的增殖反應能力,見表 5。說明N-CWS具有促進 T淋巴細胞增殖的作用。

表 5 N-CWS對淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能的影響(n=5)Table 5 Effects ofN-CWS on lymphocyte transformation(n=5)

3 討論

本課題組前期工作表明,注射給藥N-CWS不但在實驗模型而且在臨床觀察中都顯示出增加宿主抗癌免疫功能而達到延長宿主生存期的作用。研究亦顯示,具有抗腫瘤作用的N-CWS其機制與調(diào)節(jié)機體的免疫功能有關[6]。本實驗嘗試灌胃給藥,結果證實N-CWS具有明顯抑制 S180腹水型轉(zhuǎn)實體瘤的作用。同時實驗發(fā)現(xiàn),以此給藥方式N-CWS不僅對小鼠非特異性免疫功能有增強作用,而且對特異性免疫功能也有明顯的促進作用。低劑量N-CWS即已顯示明顯的MΦ激活效果,在MΦ吞噬活性增強的同時促進胸腺和脾臟器官的增長、白細胞數(shù)量顯著的提升,且提高 T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率,促進 T淋巴細胞的生成,提示在適當?shù)膭┝肯翹-CWS具有刺激 T細胞、NK細胞和B細胞的作用。體內(nèi)W inn中和試驗證實了經(jīng)N-CWS口服給藥激活的小鼠腹腔MΦ對腫瘤細胞的細胞毒效應明顯增強,提示增強機體的細胞免疫功能是其抗腫瘤的重要機理。有關口服N-CWS促進白細胞介素-2和腫瘤細胞壞死因子-α生成等研究工作我們也將后續(xù)展開,為進一步闡明N-CWS提高機體免疫抗腫瘤的作用機制和開發(fā)NCWS口服給藥的臨床應用提供更多的理論依據(jù)。

1 Zhang ZL(張祝蘭),Lin S(林善),TangWL(唐文力),et al.Studies on the physico-chemical properties,composition and content determination ofNocardia rubracell wall skeleton.Chin J Antibiotics(中國抗生素雜志),2002,27:532-534.

2 Azuma I,Taniyama T,YamawakiM,et al.Adjuvant and antitum or activities ofNocardia rubracellwall skeletons.Gann, 1976,67:733-736.

3 Azuma I,YamawakiM,Yasumoto K,et al.Antitumor activity ofNocardia rubracell wall skeleton preparation in transplantable tumors in syngeneic mice and patients with malignant pleurisy.Cancer Imm unol Imm unother,1978,4:95-100.

4 Ye BP(葉波平),Wang Y(王穎),Jin GQ(金國虔),et al. A new way ofNocardia rubracellwall skeleton(N-CWS)in treating liver disease(紅色奴卡氏放線菌細胞壁骨架用于治療肝臟疾病的新用途).CN100341574C,2007-10-10.

5 Li H(李惠).Observation and nursing of N-CWS in treating malignant hydrothorax.Practical J Cardiac Cerebral Pneum al and VascularD isease(實用心腦肺血管病雜志),2003,11: 308-309.

6 Lin YX(林躍鑫),Sheng Y(盛盈),Lu ZX(路歧詳),et al. Inhibitory Effect ofNocardia rubracell wall skeleton(NCWS)on mice bearing lewis lung carcinoma.J Fujian Normal Univ(福建師范大學學報),2003,19(3):67-69

Effect ofNocardia rubraCellWall Skeleton(N-CW S)on Transplanted Tumor and Immunological Function in M ice Given Through Oral Adm in istration

ZHANG Zhu-lan＊,TANGWen-li,YANG Huang-jian,WANG Juan,HONG Jin-ji
Fujian Institute of M icrobiology,Fuzhou 350007,China

Itwas studied the effect ofNocardia rubracellwall skeleton(N-CWS)on transplanted tumor and immunological function in mice given in oral administration.Transplanted tumormodel of sarcoma 180 in mice was used to evaluate the antitumor effect ofN-CWS.Meanwhile the immune organ weights,the phagocytosis of peritonealmacrophage and the lymphocyte transfor mation were determined in nor malmice.After oral administration ofN-CWS 200,400,800 mg/kg to mice,the inhibition rates on sarcoma 180 were 63.33%,71.11%,64.88%.The medial lethal dose(LD50)of N-CWS wasmore than 1.2 g/kg.Comparedwith control group,the spleen and thymusweights in nor malmicewere increased obviously(P<0.05),the lymphocyte transfor mation and the phagocytosisofperitonealmacrophage from micewere also increased(P<0.05).In conclusion,N-CWS could be given via oral administration.It has the antineoplastic effect,partially,by enhancing immunological function.

N-CWS;antitumor;immunological function;drug administration route

1001-6880(2010)02-0228-04

2009-03-19 接受日期:2009-05-18

福建省自然科學基金項目(2007J0248)

＊通訊作者 Tel:86-591-83470740;E-mail:jessylan9963@sina.com

R392;Q58

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