PPARγ激動劑對急性胰腺炎小鼠肝損傷的影響

孫俊濤 許剛 田克立

·短篇論著·

PPARγ激動劑對急性胰腺炎小鼠肝損傷的影響

孫俊濤 許剛 田克立

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是一類依賴配體活化的轉錄因子，許多研究表明PPARγ通過抑制NF- κB的活化來發揮抗炎作用[1-3]。本實驗應用PPARγ激動劑干預急性胰腺炎(AP)小鼠，觀察其肝臟NF-κB和PPARγ的表達，探討AP肝功能損傷機制及探索新的治療途徑。

一、材料和方法

1．實驗動物及分組：健康雄性昆明小鼠72只，體重(30±2)g，購自山東大學實驗動物中心。按數字表法將小鼠隨機分為對照組、AP組和羅格列酮干預組(干預組)，每組24只。采用腹腔注射雨蛙肽(50 μg/kg體重，Sigma公司)建模，每小時注射一次，共7次。干預組在建模前30 min腹腔內注射羅格列酮(CAYMAN CHEMICAL 公司)10 mg/kg體重，AP組注射等容積的生理鹽水，對照組僅腹腔注射等量生理鹽水。制模后6、12、24 h摘眼球取血，分離血清。引頸脫臼處死小鼠，收集肝臟標本，液氮凍存。

2．血清淀粉酶、ALT和AST含量檢測：采用TOSHIBA-40FR全自動生化分析儀測定。

3．肝臟組織NF-κB和PPARγ mRNA測定：采用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取肝組織總RNA。采用RT-PCR法檢測NF-κB和PPARγ mRNA。PPARγ 上游引物 5′-CGTGATGGAAGACCACTCGC-3′，下游引物5′-AACCTGATGGCATTGTGAGA-3′，產物477 bp; NF-κB上游引物5′-GTGACAAGCCTGTAGCC-3′，下游引物 3′-CCAGATGAAACCCTAGTAA-5′ ,產物867 bp；內參β-actin上游引物5′-TGGTGGGAATGGGTCAGA-3′，下游引物 5′-ACGGTTGGCCTTAGGGTT-3′,產物218 bp。逆轉錄反應按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis試劑盒(Invitrogen公司)說明書進行。PPARγ PCR反應條件：94℃ 1 min，60℃ 50 s，72℃ 1 min，32個循環。β-actin反應條件：94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min， 28個循環。NF-κB反應條件：94℃ 1 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min， 35個循環。擴增產物經電泳分離,圖像分析儀掃描，利用AlphaImager2200軟件進行灰度測定，以目的條帶與內參β-actin的灰度值比作為mRNA的相對表達量。

4．肝組織PPARγ和NF-κB蛋白表達檢測：采用Western blotting方法。組織蛋白按PIPA裂解液(蓋寧生物科技有限公司 )說明書提取。抗NF-κB p65、PPARγ、β-actin抗體均購自Santa Cruz公司。結果用圖像掃描分析，以目的蛋白與內參蛋白灰度值比表示蛋白相對表達量。

二、結果

1．血清淀粉酶、ALT和AST的變化：AP組和干預組血清淀粉酶、ALT和AST水平均較對照組顯著升高(P值均lt;0.01)；干預組血清淀粉酶、ALT和AST水平又均顯著低于同時間點的AP組(P值lt;0.01或lt;0.05，表1)。

2．肝臟組織PPARγ和NF-κB mRNA表達的變化：AP組PPARγ mRNA表達較對照組下降，6 h和12 h點具有統計學差異(Plt;0.01和Plt;0.05)；干預組PPARγ mRNA表達水平明顯高于同時點的AP組和對照組(P值均lt;0.01，表1，圖1)。AP組NF-κB mRNA表達水平較同時點對照組均顯著升高(P值均lt;0.01)，其中以12 h時升高最顯著；干預組NF-κB mRNA表達明顯高于對照組但又均顯著低于同時點AP組(P值均lt;0.01，表1，圖2)。

3．肝臟組織PPARγ和NF-κB 蛋白表達的變化：AP組PPARγ蛋白表達均低于同時點的對照組(P值均lt;0.05)；干預組PPARγ蛋白表達均顯著高于同時點AP組和對照組(P值均lt;0.01，表1，圖3)。肝臟組織NF-κB p65蛋白各時點的表達結果均為AP組gt;干預組gt;對照組，各時點各組間均有顯著性差異(P值均lt;0.01)，其中AP組在制模后12 h升高最顯著(表1，圖4)。

1、3、5分別為24、12、6 h干預組；2、4、6分別為24、12、6 h AP組；7為6 h對照組

圖1小鼠肝臟組織PPARγ mRNA 的表達

1、3、5分別為24、12、6 h干預組；2、4、6分別為24、12、6 h AP組；7為6 h對照組

圖2 小鼠肝臟組織NF-κB mRNA 的表達

注：與對照組比較，aPlt;0.05，bPlt;0.01；與AP組比較，cPlt;0.05，dPlt;0.01

1、3、5分別為24、12、6 h AP組；2、4、6分別為24、12、6 h干預組；7為6 h對照組

圖3小鼠肝臟組織PPARγ蛋白表達

1、3、5分別為24、12、6 h AP組；2、4、6分別為24、12、6 h干預組；7為6 h對照組

圖4小鼠肝臟組織NF-κBp65蛋白表達

討論AP常伴有全身炎癥反應綜合征(SIRS)發生,若得不到有效控制，可并發多器官功能衰竭綜合征(MODS),最終危及生命。肝臟具有物質代謝、分泌、排泄和生物轉化等功能。因其血供豐富，在AP時非常容易合并損傷，80%的AP患者有肝功能損害[4]。肝臟損害程度與AP嚴重程度密切相關，且影響病程和預后。本實驗結果顯示，AP組和干預組小鼠血清淀粉酶、ALT和AST水平較對照組均明顯升高；干預組又明顯低于AP組，說明AP組存在肝損傷，而羅格列酮能減輕肝損傷的程度。

Dunn等[5]在AP早期的胰腺提取物中發現NF-κB DNA結合活動明顯增強，而抑制NF-κB活性可阻止淀粉酶水平升高，促進炎癥恢復。Satoh等[6]報道，NF-κB在AP造模后6 h就出現活化。本實驗用雨蛙肽復制AP模型，結果顯示對照組肝臟NF-κB微弱表達；AP組肝臟NF-κB活性明顯升高，說明AP時肝臟組織中NF-κB被活化；干擾組小鼠肝臟NF-κB的表達則明顯低于AP組，表明羅格列酮對AP小鼠肝臟NF-κB表達有抑制作用。實驗證實，NF-κB的活化能增加炎癥介質(如IL-6、IL-8、TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1等)的表達[7-8]。因此，羅格列酮通過抑制NF-κB活化而減輕組織的損害。

近年研究發現，PPARγ除在糖和脂肪代謝、免疫調節、細胞生長和分化中起作用外，還在炎癥反應中發揮著重要作用。Rollins等[9]應用PPARγ激動劑能呈劑量依賴性減輕AP的嚴重程度，認為PPARγ在AP早期階段的炎癥級聯中起著直接作用。Ivashchenko等[10]報道，雨蛙肽能加重胰腺上皮PPARγ敲除小鼠所致的炎癥反應，且羅格列酮在水腫、巨噬細胞浸潤和促炎細胞因子表達方面的抗炎效應與對照組相比顯著減弱，提示胰腺上皮PPARγ在抑制炎癥過程中發揮重要作用。本實驗結果顯示，PPARγ在AP組肝臟中表達明顯降低，羅格列酮干預后，PPARγ表達量顯著升高，與國外研究結果一致。

總之，肝臟NF-κB參與并能加重AP時肝損傷過程，羅格列酮有可能通過激活PPARγ的活性、抑制NF-κB的活化起到減輕肝臟損傷程度的作用，為AP治療提供新的思路。

[1] Sen R,Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences.Cell,1986,46:705-716.

[2] Straus DS,Pascual G,Li M,et al. 15-Deoxy-D12,14-prostaglandin J2 inhibits multiple steps in the NF-kappaB signaling pathway.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:4844-4849.

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[4] Blamey SL,Imrie CW,O′Neill J,et al.Prognostic factors in acute pancreatitis.Gut,1984,25:1340-1346.

[5] Dunn JA,Li C,Ha T,et al.Therapeutic modification of nuclear factor-kappaB binding activity and tumor necrosis factor-alpha gene expression during acute biliary pancreatitis.Am Surg,1997,63:1036-1043.

[6] Satoh A,Shimosegawa T,Fujita M,et al.Inhibition of nuclear factor-kappaB activation improves the survival of rats with taurocholate,pancreatitis.Gut,1999,44:253-258.

[7] Xue D,Zhang W,Zhang Y,et al.Adjusting effects of baicalin for nuclear factor-kappaB and tumor necrosis factor-alpha on rats with caerulein-induced acute pancreatitis.Mediators Inflamm,2006,26295.

[8] Algül H,Tando Y,Schneider G,et al.Acute experimental pancreatitis and NF-kappaB/Rel activation.Pancreatology,2002,2:503-509.

[9] Rollins MD,Sudarshan S,Firpo MA,et al.Anti-inflammatory effects of PPAR-gamma agonists directly correlate with PPAR-gamma expression during acute pancreatitis.J Gastrointest Surg,2006,10:1120-1130.

[10] Ivashchenko CY,Duan SZ,Usher MG,et al. PPAR-gamma knockout in pancreatic epithelial cells abolishes the inhibitory effect of rosiglitazone on caerulein-induced acute pancreatitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,293:G319-G326.

2009-05-20)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.023

257034 山東東營，山東省東營市勝利油田中心醫院消化內科(孫俊濤)；中國人民解放軍濟南軍區第四五六醫院消化內科(許剛)；山東大學醫學院生物化學與分子生物學研究所(田克立)

田克立，Email:tiankeli@sdu.edu.cn