PARP-1 mRNA表達在急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷中的作用

余佳 王衛星 徐勝 鄧文宏 陳曉燕 崔周軍 陳辰

·短篇論著·

PARP-1 mRNA表達在急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷中的作用

余佳 王衛星 徐勝 鄧文宏 陳曉燕 崔周軍 陳辰

急性胰腺炎肺損傷(acute pancreatitis associated-lung injury，APALI)是重癥急性胰腺炎(SAP)最常見胰外并發癥，也是SAP患者早期病死的主要原因[1]，其發病機制至今仍未完全闡明。研究表明，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)在眾多生物學過程中發揮廣泛的生理作用，與多種炎癥疾病如膿毒癥、胰腺炎并發的多器官功能障礙等的發生發展有關[2-4]。本實驗觀察PARP-1 mRNA在急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺組織中的表達，并探討其在肺損傷發病機制中的作用。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：SPF級6～7周齡雄性Wistar大鼠32只，體重200～240 g，購自湖北省疾病控制中心。按數字表法隨機分為假手術組及ANP 3、6、12 h組，每組8只。采用胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉(美國Sigma公司)1 ml/kg體重方法制備ANP模型。假手術組開腹后僅翻動十二指腸和胰腺即關腹。

2．標本采集和檢測指標：術后3、6、12 h分批處死大鼠，心臟采血，分離血清，以全自動生化分析儀采用酶顯色法測定血清淀粉酶水平。取胰腺頭部和右肺下葉經4%多聚甲醛固定后，包埋、切片、HE染色，由兩位病理科醫師采用雙盲法在光鏡下觀察胰腺及肺組織病理學改變并評分。胰腺病理評分參照Schmidt法[5]；肺組織病理評分參照Osman法[6]。取右肺中葉，以吸水紙拭去表面血跡和水分，稱濕重后85℃烘烤48 h再稱重，計算肺組織的濕/干比。其余肺組織經液氮固定，-80℃凍存。取約80 mg肺組織，用Trizol提取總RNA。采用RT-PCR方法測定肺組織PARP-1mRNA表達。PARP-1(442 bp)上游5′-ACGCACAATGCCTATGAC-3′，下游5′-CCAGCGGAACCTCTACAC-3′；β-actin(207 bp)上游5′-CCAACTGGGACGATATGGAG-3′，下游5′-CAGAGGCATACAGGGACAAC-3′，引物由Invitrogen公司合成。PCR反應條件： 94℃ 5 min，94℃ 30 s、53.7℃(PARP)或54℃(β-actin)30 s、72℃ 1 min，35個循環，72℃延伸7 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，應用圖像分析儀掃描，以PARP-1與β-actin條帶光密度比值表示PARP-1 mRNA的表達量。

二、結果

1．一般情況：造模后ANP組大鼠精神和活動度變差，蜷縮，煩渴，毛色不勻齊且光澤晦暗。12 h時死亡1只(12.5%)。

2．血清淀粉酶的變化：假手術組和ANP 3、6、12 h組的血清淀粉酶水平分別為(1179±3235)U/L、(3864±529)U/L、(4876±805)U/L、(6532±1050)U/L，呈時間依賴性明顯升高(P<0.05)。

3．胰腺組織病理改變：ANP組胰腺有不同程度的水腫、出血及片狀壞死，腺葉間隙增寬和炎性細胞浸潤。假手術組和ANP 3、6、12 h組的胰腺病理評分分別為0.28±0.05、6.38±0.76、8.73±0.55、11.4±1.13，呈時間依賴性明顯升高(P<0.05)。

4．肺組織病理改變及濕/干比的變化：ANP 3 h組肺組織充血、出血、間質水腫，肺泡間隔增寬，炎癥細胞浸潤；6 h組肺泡腔內滲出液增多，部分肺泡萎縮或形成肺大泡，肺組織結構破壞，炎性細胞浸潤增加；12 h組可見出血和大片實變(圖1)。假手術組和ANP 3、6、12 h組的肺組織病理評分分別為0.22±0.02、1.21±0.11、1.72±0.14、2.2±0.35；濕/干比分別為1.77±0.23、2.05±0.12、2.43±0.14和2.97±0.36，均呈時間依賴性明顯升高(P<0.05)。

圖1假手術組(a)和ANP 3(b)、6(c)、12 h(d)組肺組織的病理改變(HE ×200)

5．肺組織PARP-1 mRNA表達的變化：假手術組和ANP 3、6、12 h組肺組織PARP-1 mRNA表達量分別為0.13±0.04、0.25±0.07、0.37±0.11、0.51±0.14(圖2)，呈時間依賴性升高(P<0.05)。肺組織PARP-1 mRNA表達與胰腺組織病理評分、肺組織病理評分均存在正相關關系，其相關系數分別為0.943、0.963(P<0.05)。

圖2假手術組(1，5)和ANP 3(2，6)、6(3，7)、12 h(4，8)組肺組織PARP-1 mRNA的表達

討論多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)是一類普遍存在于真核細胞(除外酵母菌)中的蛋白質翻譯后修飾酶，是一個至少由18種蛋白組成的大家族，包括PARP-1、PARP-2、PARP-3、Vault-PARP和Tankyrases等亞型[2]。PARP-1約占細胞PARP活性的90%以上[7]，被認為是DNA損傷的感受器，在修復DNA斷裂、維持基因組的完整性方面起著重要的作用。

PARP-1所涉及炎癥的病理過程，包括關節炎、Crohn病、潰瘍性結腸炎，以及膿毒癥、嚴重燒傷、胰腺炎并發的多器官功能障礙等[3]。過強的DNA損傷可引起PARP-1過度激活，產生的PAR會導致尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和ATP耗竭，同時也破壞了細胞核內的穩態環境，引起細胞死亡、組織損傷和器官衰竭，導致病情惡化甚至死亡率升高[2-4]。本實驗結果顯示，制模后大鼠血清淀粉酶升高，胰腺病理損傷加重，肺組織濕/干比和病理評分明顯升高。同時，肺組織PARP-1 mRNA表達逐漸上調，且表達水平與胰腺損傷程度、肺損傷程度呈正相關，表明大鼠肺組織內PARP-1參與了胰腺炎時肺損傷的發病過程，與Mota等的研究結果一致。其機制可能是：(1)通過激活NF-κB等炎癥信號通路，引起TNF-α、IL-1等炎癥介質產生和釋放增多，造成器官組織損傷；(2)嗜中性粒細胞NADPH氧化酶釋放，促使活性氧生成增加，引起DNA單鏈斷裂，導致PARP-1過度活化和細胞能量儲備的耗竭，從而使線粒體氧自由基產生，胰腺和肺臟細胞壞死[8-9]。

[1] Lund H,T?nnesen H,T?nnesen MH,et al.Long-term recurrence and death rates after acute pancreatitis.Scand J Gastroenterol,2006,41: 234-238.

[2] Amé JC,Spenlehauer C,de Murcia G.The PARP superfamily.Bioessays,2004,26: 882-893.

[3] Cuzzocrea S,Wang ZQ.Role of poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) in shock,ischemia and reperfusion.Pharmacol Res,2005,52:100-108.

[4] Jagtap P,Szabó C.Poly (ADP-ribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors.Nat Rev Drug Discov,2005,4:421-440.

[5] Schmidt J,Lewandrowsi K,Warshaw AL,et al.Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat.Int J Pancreatol,1992,12:41-51.

[6] Osman MO,Kristensen JU,Jacobsen NO,et al.A monoclonal anti-interleukin 8 antibody (WS-4) inhibits cytokine response and acute lung injury in experimental severe acute necrotising pancreatitis in rabbits.Gut,1998,43: 232-239.

[8] Rakonczay Z Jr,Hegyi P,Takács T,et al.The role of NF-kappaB activation in the pathogenesis of acute pancreatitis.Gut,2008,57: 259-267.

[9] Virág L.Structure and function of poly (ADP-ribose) polymerase-1:role in oxidative stress-related pathologies.Curr Vasc Pharmacol,2005,3:209-214.

2009-07-22)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.020

湖北省自然科學基金項目資助(2008CDB394)

430060 武漢，武漢大學人民醫院肝膽腔鏡外科(余佳、王衛星、徐勝、鄧文宏、陳曉燕、崔周軍、陳辰)；廣西壯族自治區人民醫院肝膽外科(徐勝)

王衛星，Email:sate.llite@163.com