miR-101在胰腺癌組織中的表達以及對胰腺癌細胞ASPC-1增殖的影響

李先鵬 郭世偉 金震東 曲樂

·論著·

miR-101在胰腺癌組織中的表達以及對胰腺癌細胞ASPC-1增殖的影響

李先鵬 郭世偉 金震東 曲樂

目的觀察miR-101在胰腺癌組織中的表達，探討其對胰腺癌細胞增殖的影響。方法采用實時定量PCR方法檢測miR-101在胰腺癌組織、癌旁組織和胰腺癌細胞株ASPC-1中的表達。通過基因重組技術構建miR-101的表達載體peGFPc1-miR-101，應用脂質體將其轉染到ASPC-1細胞，熒光顯微鏡檢測轉染效率；實時定量PCR檢測轉染細胞miR-101的表達水平，以癌旁正常胰腺組織為1，折算成相對倍數；MTT法檢測轉染細胞的增殖率。利用在線軟件targetScan預測miRNA可能的靶基因。結果miR-101在胰腺癌組織和胰腺癌細胞株ASPC-1中相對表達量分別為55%和39%，較癌旁正常胰腺組織顯著降低(P<0.01)。peGFPc1-miR-101轉染ASPC-1細胞后，miR-101表達增加，為對照組的19.8倍(P<0.01)，癌細胞增殖率明顯降低，最低僅為原代細胞的26%(P<0.01)。EZH2基因是miR-101影響胰腺癌細胞增殖活力的可能靶基因。結論胰腺癌組織miR-101低表達，它可能通過抑制EZH2的表達調控細胞的增殖。

胰腺腫瘤； miR-101； 細胞增殖

微小RNA(microRNA，miRNA)是近期發現的生物體內源長度約為19～25個核苷酸的非編碼小RNA，通過與靶基因miRNA的3′非翻譯區(3′-UTR)互補配對，而在轉錄后水平上對基因的表達進行調控，導致miRNA的降解或翻譯抑制。最近幾年的研究發現，miRNA與人類腫瘤的發生、發展關系密切，在各種腫瘤組織中存在miRNA的異常表達[1]。目前已有胰腺癌組織的miRNA異常表達譜的報道[2]，但針對某一特定異常表達的miRNA在胰腺腫瘤發生、發展中的功能作用尚缺乏研究。為此，本實驗檢測miR-101在胰腺癌組織中的表達，探討其對胰腺癌細胞增殖的影響。

材料與方法

一、材料

真核表達質粒載體peGFPc1購自Clonetech公司，E.coli DH5α感受態細胞購自天根生物公司。胰腺癌細胞株ASPC-1為本實驗室凍存。3例胰腺癌及其相應癌旁正常胰腺組織為長海醫院手術切除的新鮮標本。Trizol、脂質體、miRNAs檢測試劑盒等均購自Invitrogen公司，限制性內切酶、凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA marker、反轉錄酶、實時定量PCR試劑等均購自TAKARA公司，MTT試劑盒購自天根生物公司。

二、方法

1．miR-101表達的檢測：采用Trizol法提取胰腺癌組織、癌旁組織及胰腺癌細胞株ASPC-1細胞的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳以及分光光度計分別檢測RNA濃度和質量。

根據Gene Bank公布的人miR-1基因的序列，用primer primerer5.0軟件設計克隆引物。miR-101-F：GAAGATCTATATGGCCCATCTGAGGTTG，含Bgl Ⅱ酶切位點；miR-101-R：CCCAAGCTTAAAAACCTCCCACCACGAAT，含Hind Ⅲ酶切位點。內參U6購自Invitrogen公司。引物由Invitrogen公司合成。以100 ng總RNA為模板，逆轉錄cDNA，RT反應條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。再利用taqman miRNA assay進行實時PCR。PCR反應：94℃ 10 min， 94℃ 30 s、60℃ 1 min，45個循環。每組實驗重復3次，結果用Ct值分析，以癌旁正常胰腺組織表達量為1，折算為相對倍數。每組PCR實驗均以持家基因U6作為內參。

2．miR-101表達載體構建及細胞轉染：以人的基因組DNA為模板，PCR法擴增miR-101片段。 PCR反應條件：94℃ 10 min，94℃ 30 s、55℃ 20 s、72℃ 15 s，30個循環，72℃延伸5 min。擴增片段經電泳分離、回收，由Invitrogen公司負責測序。測序正確后，應用限制性內切酶酶切，連接至質粒peGFPc1中，構建miR-101表達載體peGFPc1-miR-101。

將ASPC-1細胞按1×104個/孔的密度接種于96孔板常規培養。待細胞生長密度達60%～70%后，采用脂質體Lipofectamine-2000將peGFPc1-miR-101轉染細胞。以僅加入脂質體的細胞作為陰性對照。

3．轉染細胞增殖率檢測：轉染后0、12、24、48、72 h收集細胞，采用MTT法檢測細胞增殖活力。細胞相對增殖率=(實驗孔A530-空白孔A530)/(陰性對照孔A530值-空白孔A530)。實驗重復3次，取均值。

4．miRNA靶基因的預測：采用miRNA靶基因預測軟件targetScan(http://www.targetscan.org/)篩選miR-101靶向作用的基因。

結 果

一、 miR-101在胰腺癌組織中的表達

miR-101在胰腺癌和胰腺癌細胞株ASPC-1的相對表達量分別是癌旁正常胰腺組織的55%和39%，較癌旁正常胰腺組織顯著降低(P<0.01)。

二、peGFPc1-miR-101的鑒定

帶GFP報告基因的peGFPc1-miR-101轉染細胞24 h后，>70%的ASPC-1細胞內出現綠色熒光基因信號(圖1a)。轉染細胞的miR-101表達量明顯升高，為陰性對照組的19.8倍(P<0.01)，陰性對照組和空白對照組之間無明顯變化 (圖1b)。

圖1peGFPc1-miR-101轉染的ASPCA-1細胞(a)及其miR-101表達(b)

三、轉染細胞增殖的變化

轉染后12 h，細胞的增殖率降低，為對照組的85%；轉染后24 h，增殖率僅為對照組的27%(P<0.01)；轉染后72 h，增殖率為對照組的26%(P<0.01，圖2)。

圖2 轉染后ASPC-1細胞的生長曲線

四、miR-101抑制靶基因的篩選

根據targetScan的預測，miR-101在Zeste基因增強子(EZH2)的3′-UTR區域中有兩個作用位點，能較強地抑制該基因的表達(圖3)。

圖3 miR-101在Zeste基因增強子(EZH2)的靶位點

討 論

隨著研究的不斷深入，目前認為miRNA在腫瘤的發生發展過程中具有與癌基因或抗癌基因相似的作用[3]。因此，深入研究miRNA在腫瘤中的功能，了解其作用的機制和通路，對腫瘤的治療、診斷以及進程監控都具有重要意義[4]。

miR-101是脊椎動物所特有的一個miRNA，它有兩個前體，分別位于人的1號染色體和9號染色體中，但其成熟序列在各個物種中高度保守。目前已有研究證實，miR-101在肝癌、前列腺癌等實體腫瘤中發揮著重要的作用[5-7]。本結果顯示，miR-101在胰腺癌組織中表達降低，而轉染表達miR-101的胰腺癌細胞的增殖被明顯抑制，提示miR-101在胰腺癌的發生發展過程中起著如同抑癌基因的重要作用。Zeste基因增強子(EZH2)基因是哺乳動物細胞中的一個組蛋白甲基化酶，具有促進目標基因沉默的能力，對癌細胞的存活和轉移也具有重要的調控功能。

EZH2過度表達會導致癌細胞具有侵入性，加快實體腫瘤組織癌細胞的增殖和轉移[8]。本實驗預測miR-101靶點在EZH2基因的3′-UTR區域，能抑制該基因的的轉錄后水平，從而達到抑制癌細胞的增殖和轉移，與本實驗結果相符。

最近也有研究發現，肝癌細胞的抗凋亡基因MCL-1也是miR-101的靶基因之一[4,9-10]。MCL-1是一種受高度調節的蛋白，其表達受到各種生存及分化信號的調節。細胞凋亡的過程中它的表達下調，在細胞的存活過程中起著至關重要的作用。因此推測，在胰腺癌細胞的增殖過程中，MCL-1基因的表達可能也受miR-101的調控。

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2010-05-26)

(本文編輯：屠振興)

TheexpressionofmiR-101inpancreaticcanceranditseffectonproliferationofpancreaticcancercelllineASPC1

LIXian-peng,GUOShi-wei,JINZhen-dong,QULe.

DepartmentofGatroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ObjectiveTo investigate the expression of miR-101 in pancreatic cancer and the effect of down-regulation miR-101 on proliferation of pancreatic cancer cell line ASPC1.MethodsReal-time PCR was used to determine the expression of miR-101 in pancreatic cancer, adjacent tissues and pancreatic cancer cell line ASPC-1. The miR-101 over-expression vector (peGFPc1-miR-101) was constructed and was transfected into ASPC-1 cell. Transfection efficiency was measured by fluorescence microscope. The expression of miR-101in the transfected cells was detected by real-time PCR. Cell viability analysis was performed by MTT. The targeted genes of miR-101 in pancreatic cancer were scanned by the online targeted gene prediction software (target Scan).ResultsThe expression of miR-101 was in pancreatic cancer tissues, adjacent tissues and ASPC-1 cell line, respectively. The expressions in pancreatic cancer tissues and ASPC-1 cells were significantly lower than that in adjacent tissues (P<0.01). The expression of miR 101 in transfected cells increased to 19.8 folds as much as that in the control group (P<0.01). Proliferation rate of transfected cells was significantly decreased, which was only 26% of primary cells (P<0.01). EZH2 was the potential targeted gene of miR-101 in pancreatic cancer.ConclusionsmiR-101 was weakly expressed and it may affect the proliferation of pancreatic cancer cell by inhibiting the EZH2 expression.

Pancreatic neoplasms; miR-101; Cell proliferation

Correspongdingauthor：JINZhen-dong,Email:zhendjin@126.com

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.016

200433 上海，第二軍醫大學附屬長海醫院消化內科(李先鵬、金震東)，普外三科(郭世偉)；第二軍醫大學(曲樂)

共同第一作者：郭世偉

金震東，Email:zhendjin@126.com