5-羥色胺2A受體阻滯劑保護糖尿病大鼠陰莖勃起功能作用的研究△

寧夏醫科大學附屬醫院(銀川 750004)

陳 凌 何蘭杰★ 李國徽*

勃起功能障礙(Erectile dysfunction,ED)是糖尿病常見并發癥(DED),其發病機制尚不十分清楚,也缺乏有效的防治措施。血管因素在 DED形成過程中起著重要的作用,主要包括由舒縮血管因子比例失衡引起的血管舒縮活動紊亂及血管系統的病理損傷。5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)是一種具有多種功能的神經介質和血管活性物質,通過作用于血小板和血管內 2A型受體(5-HT2AR)參與了包括血小板聚集、活化、血栓形成、血管收縮等病理過程。已知糖尿病病人血清 5-HT濃度明顯增高,其通過 5-HT2AR收縮血管的效應顯著增強。此外,5-HT及其 2A型受體在血管內皮損傷、血管平滑肌增生及遷移、動脈粥樣硬化等過程中起重要作用,認為5-HT及其 2A型受體與糖尿病血管功能紊亂及組織病變關系密切。本實驗通過觀察 5-HT2A受體阻滯劑對糖尿病大鼠陰莖 eNOS表達水平及血清 NO、ET-1、5-HT的含量、陰莖組織病變的影響,探討 5-HT及其 2A型受體參與DED發病的機制。

材料與方法

1 材 料

1.1 試劑:鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ):美國 sigma公司。鹽酸沙格雷酯(Sarpogrelate hydrochloride安布樂克):日本三菱制藥株式會社,生產批號:HG01。枸櫞酸西地那非(Sildenafil citrate萬艾可):輝瑞制藥有限公司,生產批號:55883002。阿樸嗎啡(APO):美國 Sigma公司。血清 5-HT、ET-1 ELISA檢測試劑盒,大連范邦生物科技有限公司 。血清 NO檢測試劑盒:南京建成生物工程有限公司。免疫組織化學 SP試劑盒:DAB顯色液、兔抗大鼠 eNOS抗體(工作濃度 1∶100):武漢博士德生物有限公司。

1.2 實驗動物及分組:2月齡雄性 SD大鼠 70只,體重(245±25)g(寧夏醫學院動物實驗中心提供)。大鼠適應飼養 1周,APO試驗陽性后,隨機分為常規飼料喂養組(A組 n=10),高脂高糖喂養組(B組n=60)。實驗期間大鼠自由進食、飲水。

2 方 法

2.1 糖尿病模型建立:B組大鼠高脂高糖喂養 8周后腹腔注射STZ 35mg/kg。A組大鼠常規飼料喂養,注射相同數量枸櫞酸緩沖液。注射 STZ 72h后,強生微量血糖儀檢測尾尖血糖,以血糖≥11.1mmol/L并持續 3d作為糖尿病動物模型建立標準。將成模大鼠隨機分成三組:糖尿病組 25只(DM)、鹽酸沙格雷酯干預組 14只(SH)、西地那非組14只(WG)。A組大鼠作為正常對照組(NC)。SH組大鼠給予鹽酸沙格雷酯100mg/(kg· d)灌胃,共12周;WG組大鼠在進行APO誘導陰莖勃起實驗前 3d給予西地那非20mg/(kg· d)灌胃;NC與DM組給予等量飲用水灌胃。全部大鼠于灌胃后第 12周處死。

2.2 實驗方法

2.2.1 一般項目:觀察動物的精神狀態、毛色、飲食狀況,每 4周稱量體重1次,并測量尾尖血糖。

2.2.2 陰莖勃起試驗:在第 0、4、8、12周進行APO誘導陰莖勃起試驗,參考 Heaton等皮下注射APO的方法[1]。大鼠置于安靜且光線暗的環境中,稱重后,每只大鼠在頸部皮下注射 APO,劑量為80μg/kg。陰莖頭露出,包皮后退,陰莖膨大為陰莖勃起 1次,視為APO實驗陽性。每只大鼠觀察 30min記錄,陰莖勃起次數和勃起率,以陰莖無勃起為判斷 ED標準。

2.2.3 血清 NO檢測:硝酸還原酶法測定,按試劑盒說明操作。

2.2.4 血清胰島素 5-羥色胺(5-HT)、內皮素-1(ET-1)ELISA檢測,按試劑盒說明操作。

2.2.5 免疫組織化學檢測:采用 SP法,嚴格按說明書步驟進行操作。實驗同時采用 PBS代替一抗作為陰性對照,以已知陽性片作陽性對照。以 DAB顯色,蘇木素復染。顯色結果在高倍鏡下根據染色區變化和染色強度進行半定量分析:0分,無陽性染色染色(染色面積 0～25%);1分,輕度陽性(染色面積 26%～50%);2分,中度陽性(染色面積 51%～75%);4分,重度陽性(染色面積 76%～100%)。

2.2.6 常規 HE染色及H-600透射電鏡觀察形態:完整切取陰莖海綿體組織,剪去包皮及軟骨,橫切一小段立即浸入10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,制備4μm厚的切片;另切一段陰莖組織,低溫下細切為1mm×1mm×1mm小塊,置于含 4%戊二醛中前固定,留于透射電鏡檢測。

2.3 統計學處理:應用 SPSS12.0統計學軟件,實驗數據以±s表示,各組數據采用 ANOVA方差分析,同時行多樣本均數間的兩兩比較,免疫組織化學半定量評分采用秩和檢驗。

結 果

1 一般情況及生化變化:未成模大鼠 7只,有19只大鼠在注射 STZ后不同時期死亡。實驗結束時,NC組 10只,DM組 18只,SH組 8只,WG組 8只。糖尿病大鼠均出現典型“三多一少”癥狀,毛發枯黃無光澤,部分大鼠出現爛尾、肢體感染和潰瘍等合并癥。12周時 DM、SH、WG組血糖水平較 NC組明顯升高(P＜0.01)。與DM組相比,鹽酸沙格雷酯干預治療未改善糖尿病大鼠的多飲、多尿、多食、體重減輕的癥狀。SH組血糖水平較 SL、DM、WG組有所下降,但各組之間血糖無顯著差異,見表1。

2 大鼠陰莖勃起功能 APO實驗測定:DM組陰莖勃起率、勃起次數隨糖尿病病程延長呈進行性下降趨勢。與NC組相比,DM組大鼠各期勃起次數均明顯低于NC組 P＜0.01),兩組比較 8周時 P＜0.05,12周時 P＜0.01。WG組為陽性對照組,西地那非干預能顯著改善大鼠勃起功能,與DM組相比,WG組各期勃起次數及勃起率有不同程度上升,其中 4、8周勃起次數比較 P＜0.01,WG組各期勃起率均高于同期 DM組水平,但無統計學差異。與DM組相比,SH組各期勃起率及勃起次數均高于同期 DM組相應指標水平,8周時勃起次數比較 P＜0.05。與WG組比較,4周時SH組勃起率及勃起次數均低于WG組(P＜0.05),8周時 SH上述指標與WG組接近(P＞0.05),12周時SH組勃起率均高于WG組,同期勃起次數 SH組高于WG組,但無統計學差異,見表2。

3 干預治療對血清 NO、ET-1、5-HT及NO/ET-1的影響:12周病程 DM組大鼠血清 NO濃度顯著下降,5-HT、ET-1明顯升高,NO/ET-1比值顯著下降,與NC組相比 P均＜0.01。WG組上述指標與DM組比較無明顯差異。與DM組相比,SH組血清 NO濃度、NO/ET-1比值上升,血清 ET-1、5-HT水平下降,NO濃度比較 P＜0.05,NO/ET-1、5-HT比較 P＜0.01,ET-1比較無統計學差異,見表3。

表1 各組大鼠血糖、體重比較

表2 各組大鼠陰莖勃起次數和勃起率情況

表3 各組大鼠血清學指標比較

圖1 各組 eNOS免疫組化染色結果對比觀察(HE×400)(A:正常組,B:糖尿病組,C:鹽酸沙格雷酯高劑量組)

4 免疫組織化學結果:正常大鼠陰莖 eNOS表達于血管內皮細胞胞漿中,陽性顯色為褐色。實驗 12周末,半定量分析結果表明,DM組大鼠陰莖海綿體eNOS陽性染色強度顯著減弱,染色面積減少(P＜0.01)。鹽酸沙格雷酯治療后 eNOS表達較 DM組明顯上調(P＜0.01),見表4,圖1。

5 陰莖海綿體病理改變光鏡、電鏡下觀察結果:HE染色,光鏡下觀察。NC組:血竇分布均勻、神經組織及血管腔結構,血竇內少見血小板,間質組織無增生。WG、DM組:血竇分布雜亂,間質組織增生明顯,血竇腔狹窄、閉塞,內可見大量血小板成分。SH組:血竇分布均勻,竇腔狹窄程度較 DM組明顯減輕,內少見血小板成分,間質組織增生不明顯,海綿體組織結構基本完整,見圖2。

表4 各組陰莖海綿體 eNOS免疫組化檢測半定量分析結果

圖2 各組陰莖海綿體病理結構對比觀察(HE×400)(A:正常組,B:糖尿病組,C:鹽酸沙格雷酯高劑量組)

圖3 陰莖海綿體超微結構對比觀察(×5000)(A:正常組,B:糖尿病組,C:鹽酸沙格雷酯高劑量組)

電鏡觀察顯示,NC組:血竇內皮細胞質膜完整,胞漿豐富,可見多量質膜小泡,胞核型態正常;間質組織散在分布其中。DM組、WG組:血竇內皮細胞增生明顯,胞質濃集,其內內質網及線粒體等細胞器亦明顯減少,少見質膜小泡,染色質邊集或聚集成塊;增生內皮細胞形態肥大,程多邊形,相互擁擠于血竇腔內,血竇腔被部分或全部堵塞;間質組織增生明顯,成纖維細胞增生,型態異常,染色質凝集現象明顯,膠原大量堆積,排列密集。SH組:損傷較 DM組明顯減輕,海綿竇組織結構完整、細胞形態近于正常,內皮細胞無明顯增生,胞漿豐富,內可見較多質膜小泡,染色質無明顯聚集現象,膠原無明顯增生現象,見圖3。

討 論

血管舒縮動態平衡的正常調解是陰莖勃起的關鍵,任何損害或干擾這一調節過程的因素均會導致陰莖海綿體血流動力學發生變異,直接誘發 ED。5-HT是重要血管活性物質,它通過 5-HT2A受體發揮收縮血管的效應[2]。糖尿病時 5-HT的血清濃度明顯增高,這在以往及本研究中得到證實。糖尿病增高的血清 5-HT主要是由過度活化的血小板釋放而來[3]。此時,5-HT通過其 2A型受體收縮血管的效應明顯增強[4]。實驗中 SH組 DM大鼠血清 5-HT明顯下降,說明 5-HT2A受體阻滯劑可有效抑制糖尿病時血小板的過度活化,這一變化勢必減弱其收縮血管效應的發揮,同時抑制由于血小板過度活化和脫顆粒造成的血栓形成、血管內皮細胞損傷及進一步血管病變的發生,這些均有助于阻止 DED的發生和發展。此外,5-HT2A受體阻滯劑阻斷血管上 5-HT2A型受體,從而抑制 5-HT的縮血管作用,進一步校正糖尿病時血管舒縮平衡紊亂,改善 DED病情。值得注意的是,5-HT2A受體阻滯劑不僅可以減少作為縮血管物質—5-HT本身的釋放,同時可以阻斷其收縮血管效應發揮的媒介-5-HT2A受體,達到最大抑制血管收縮效應,這是其它受體阻滯劑所沒有的特點。

NO在調解陰莖血流量方面起重要作用,其濃度及功能的變化所導致的血管舒縮失衡是 DED的重要發病機制之一[5,6]。陰莖組織中的NO是由 nNOS和eNOS兩個酶系所激發,大量研究表明,eNOS在陰莖勃起過程中起到至關重要的作用[6～8]。糖尿病導致 NO合成減少,eNOS表達下降是其主要原因之一。許多研究表明伴隨糖尿病模型實驗動物勃起功能的下降,陰莖海綿體內 eNOS蛋白及基因表達均明顯下調,海綿體 NO濃度也相應下降[9,10]。本實驗與上述研究結果一致,說明糖尿病導致陰莖海綿體 eNOS表達下調進而引起的NO分泌減少是 DED發病機制之一。實驗中5-HT2A受體阻滯劑干預后海綿體 eNOS表達較 DM組明顯上調,血清 NO含量較 DM組升高,大鼠陰莖勃起功能有不同程度的改善。這一結果說明,5-HT2A受體阻滯劑保護糖尿病大鼠陰莖勃起功能的另一途徑是上調海綿體 eNOS的表達,增加 NO的分泌,糾正血管舒縮因子平衡紊亂,促進血管擴張和海綿體充血。實驗提示 5-HT收縮血管的另一機制可能是抑制內皮細胞eNOS的表達。

在正常生理條件下,由于5-HT血清濃度較低,加之眾多血管活性因子相互作用的協調,5-HT及其 2A型受體收縮血管的效應在機體正常調節下維持適當的水平,但糖尿病時增高的血清 5-HT對血管的收縮效應可能被大大擴增,特別是在可以拮抗其作用的舒血管物質(NO)同時減少或活性降低的情況下就更為嚴重。從這一意義上來說,糖尿病時由 5-HT及其 2A受體引起的血管收縮效應的增強而導致的血管舒縮平衡紊亂在 DED發病中所起到的作用可以不亞于由于NO合成減少及活性降低對 DED發病的貢獻作用。5-HT2A受體阻滯劑可以改善糖尿病大鼠勃起功能的結果表明,縮血管作用的增強是 DED發病的重要原因之一,單純增加舒血管物質的療法對于DED是不全面的。

血管內皮細胞在血管張力的調節中起重要作用。內皮細胞損傷及功能障礙是導致血管功能紊亂、組織病理改變的基礎[11]。糖尿病導致血管內皮細胞功能損傷,主要表現為對舒血管物質反應的減弱和對縮血管物質的高敏感性,同時內皮細胞所分泌的舒縮血管活性物質之間的比例失衡[12]。上述改變阻礙陰莖勃起時血管的舒張和海綿體充血,導致 DED的發生。隨著糖尿病病程的進展,內皮細胞損傷進一步發展,使其抗凝、纖溶和血管活性物質代謝以及調節血管張力等功能障礙或喪失,導致血栓形成、血管阻賽、動脈粥樣硬化的發生、發展,這些病理改變都是 EDE的發病機制之一。組織病理學觀察結果及血清 NO、NO/ET-1變化情況表明鹽酸沙格雷酯有顯著保護內皮細胞的作用。5-HT2A受體阻滯劑治療 DED的另一途徑是保護內皮細胞,阻止內皮細胞增生、損傷,從而延緩、阻止進一步嚴重血管系統病變的發生。另外,此作用可能是 5-HT2A受體阻滯劑上調 eNOS表達的機制之一。

經各項試驗結果的對比觀察可以得出結論,5-HT2A受體阻滯劑保護 DM大鼠陰莖勃起功能的機制不同于西地那非。西地那非藥效的機制是在需要時短期內增強舒血管物質 NO的生理效應,從而達到促進陰莖勃起的作用。這一機制對于NO合成顯著下降的DM患者而言,療效難以發揮,且經本實驗證實西地那非對糖尿病陰莖組織病變無顯著影響。據此推測,對已存在組織病變的患者其療效非常有限。而 5-HT2A受體阻滯劑在糾正血管舒縮平衡紊亂的同時,對糖尿病陰莖組織病理損傷有明顯的改善作用,這也是其保護陰莖勃起功能顯效較晚的主要原因。雖然 5-HT2A受體阻滯劑在短時間內增加舒血管效應的作用低于西地那非,所以在 DM早期其改善勃起功能的作用有限,但隨 DM病情的進展,該藥改善糖尿病大鼠陰莖組織病理損傷狀況的作用凸現,此時其作用逐漸顯現。

綜上所述,5-HT2A受體阻滯劑對糖尿病大鼠陰莖勃起功能有保護作用,它能使陰莖 eNOS表達上調,血清 NO濃度、NO/ET-1比值上升,改善糖尿病大鼠陰莖組織病理損傷狀況,保護內皮細胞,抑制膠原增生。結合 5-HT、5-HT2A受體在糖尿病大鼠海綿體表達的變化情況,可以得出結論5-HT及5-HT2A受體在 DED的發生中起重要作用,5-HT2A受體阻滯劑可能成為防治 DED的另一條途徑。

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