毛霉豆豉前發酵條件優化的研究

夏巖石夏延斌蔣立文

（1 湖南科技學院 生命科學與化學工程系，永州 425006; 2 湖南農業大學 食品科技學院，長沙 410128）

0. 言

豆豉是中國傳統民間豆制品之一。大豆經微生物作用后不僅保留了大豆中原有營養成分，而且除去了大豆中不利人體的溶血素和胰蛋白酶抑制劑等有害物質，同時產生一定量大豆多肽、大豆異黃酮、核黃素和維生素B12等活性成分，經酶解后的營養成分易于人體吸收，并且味道鮮美，深受人們的喜歡[1,2]。利用純毛霉接種制曲生產豆豉，因培養時間較短，成品中的氨基態氮的含量不高，貨架后期產品易出現老化品質變硬問題，影響口感。本實驗擬通過前發酵條件的優化，提高豆豉前發酵過程中蛋白酶的形成，有助后發酵過程大豆蛋白的充分分解，提高產品氨基態氮含量，降低產品硬度。

1.料與方法

1.1.料與儀器

1.1.1.輔材料

大豆、邵陽大曲酒、生姜、麩皮和土豆全部市售。

毛霉菌：由湖南農業大學微生物教研室提供。

1.1.2.要藥品與試劑

葡萄糖、干酪素、L-酪氨酸、鹽酸、磷酸、硼砂、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、氯化鈉、碘、碘化鉀、可溶性淀粉、硫酸銅、硫酸鉀、甲醛等均為分析純。

1.1.3.要試驗儀器

722S型分光光度計、SHZ-82 氣浴恒溫振蕩器、YXQ.SG46.280型高壓蒸汽消毒器、250B型恒溫生化培養箱、S-3C型pH精密計、LD4-2A式醫用離心機、SW-CJ-IB標準型凈化工作臺。

1.2.驗方法

1.2.1.種的制備

菌種的活化：將斜面菌種在無菌操作臺接種到PDA斜面培養基上，放在25～28℃恒溫培養箱中培養48～72h，放在冰箱中保存備用[3]。

生產菌種制備：在300m1三角瓶中加入15g麩皮，按麩皮與水的質量比1：1.1，混合均勻，三角瓶口塞棉塞并包扎防潮紙，于0.1MPa滅菌40min，取出搖動，冷卻到28～30℃，在無菌條件下進行接種，平置于25～28℃溫箱內，培養24h后扣瓶1次再培養，等瓶內麩皮長滿菌絲及灰色孢子后取出備用[2]。

1.2.2.發酵溫度對豆豉毛坯產蛋白酶的影響

大豆蒸熟冷卻至室溫，按3%的接種量接種優質毛霉麩曲，分別置于10℃，15℃，20℃，25℃，28℃，35℃條件培養48h后測定毛坯的蛋白酶活力，以確定適宜的前發酵溫度。

1.2.3.發酵時間對豆豉毛坯產蛋白酶的影響

大豆蒸熟冷卻至室溫，按3%的接種量接種優質毛霉麩曲，置于25℃條件下培養，24h后開始測定毛坯的蛋白酶活力，每隔6h測定一次，以確定適宜的前發酵時間。

1.2.4.H值對前發酵產蛋白酶的影響

用pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8等不同溶液制成孢子懸浮液進行接種，置25℃條件進行培養，期間用相應的pH溶液進行噴灑，維持培養期間的相對濕度，48h后測毛坯的蛋白酶活力，確定前發酵條件的適宜pH值。

1.2.5.aCl濃度對前發酵產蛋白酶的影響

用0M，0.2M，0.4M，0.6M，0.8M，1.0M等不同濃度的NaCl溶液制成孢子懸浮液進行接種，置25℃條件進行培養，期間用相應的NaCl溶液進行噴灑，維持持培養間的濕度，48h后測毛坯的蛋白酶活力，探討NaCl溶液對前發酵產蛋白酶的影響。

1.2.6.源酶處理對前發酵產蛋白酶的影響

采用30℃水浸泡大豆至衡重，濾干置30℃條件下發芽6h激活內源酶，然后在45℃利用大豆內源酶分別酶解大豆2h，4h，6h。處理后，熟化大豆進行接種，25℃，培養48h后測豆豉毛坯的蛋白酶活力。

1.2.7.豉前發酵條件正交優化試驗

表1.豉前發酵條件的試驗因素和水平

大豆于25℃浸泡至增重1～1.2倍，選擇內源酶作用溫度、內源酶作用時間、前發酵時間和NaCl濃度為試驗因素，設置三個水平，進行L9(43)的正交試驗，各因素水平列于表1。豆豉前發酵后添加適當食鹽、生姜和白酒，37℃后發酵7d，最后測定產品的氨基態氮、還原糖的含量和產品的硬度。進一步確定前發酵條件用對豆豉產品品質的影響，對各因素指標進行綜合分析，從而優化豆豉的前發酵條件。

1.3.測項目及方法

1.3.1.白酶活力的測定

1.3.1.1.酶液的制備 取一定量的豆豉毛坯，加入250毫升0.3M食鹽溶液，經高速組織搗碎攪勻后于25℃抽提1h，取清濾液適當稀釋后進行蛋白酶活力的測定。

1.3.1.2.活力的測定方法 采用福林試劑法[4]測定中性蛋白酶。酶活力定義為，在40℃，一定pH條件下1分鐘水解干酪素產生1μg酪氨酸所需的酶量為一個蛋白酶活力單位。

1.3.2.化指標的測定

氨基態氮的測定：采用甲醛法[5]。

還原糖的測定：采用3,5—二硝基水楊酸法(DNS法)[5]。

豆豉硬度的測定：采用精度0.5g藥物天平改裝成簡易硬度測定儀，天平的一端放水杯，另一端放樣品，樣品上方固定一個直徑3mm的長釘，在測定時以一定的流速添加水于水杯中，樣品所受壓力逐漸增大，直到豆豉斷裂。以豆豉的斷裂力(N)來判斷豆豉的硬度，每一批樣取10個樣品測量,取平均值[6]。

2.果與分析

2.1.發酵溫度對豆豉毛坯產蛋白酶的影響

根據實驗方法1.2.2，前發酵不同溫度條件下豆豉毛坯的蛋白酶活力為圖1。

圖1.發酵溫度對毛坯產蛋白酶的影響

圖2.發酵對毛坯產蛋白酶的影響

從圖1可知隨著培養溫度的升高，豆豉毛坯的蛋白酶活力也增加，在28℃條件下蛋白酶活達到最大，但溫度達35℃時，毛坯的蛋白酶活急劇下降。相關研究表明毛霉生長的溫度范圍內隨溫度的升高，菌體生長加快，但溫度達35℃時，毛霉菌生長受到抑制。菌體生長的優劣直接影響產酶量，豆豉前發酵的溫度選擇25～28℃有利于毛坯中蛋白酶的積累。由于豆豉前發酵是一個開放的過程，28℃培養易感染雜菌，影響成品的品質，因此選擇25℃進行前發酵比較適合。

2.2.發酵時間對豆豉毛坯產蛋白酶的影響

根據實驗方法1.2.3，前發酵不同時間豆豉毛坯的蛋白酶活力為圖2。由圖2可知，25℃條件下，隨培養時間的延長，豆豉毛坯的蛋白酶活力也增加，在48h，蛋白酶活達到最大。40～50h范圍內，毛坯的蛋白酶活力比較穩定，都有利于后發酵游離氨基酸的形成。隨著時間的延長，蛋白酶活有明顯的下降，可能是由于毛霉老化的原因。因此，豆豉前發酵制曲時間應控制在40～50h，才有利于蛋白酶的積累和后發酵蛋白質的分解。

2.3.H值對前發酵產蛋白酶的影響

根據實驗方法1.2.4，前發酵不同pH值條件豆豉毛坯的蛋白酶活力為圖3。由圖3可知，在pH5～6的范圍內，有利于豆豉毛坯積累蛋白酶，pH值過高或過低都會影響蛋白酶的產生。

圖3.H值對前發酵產蛋白酶的影響

圖4.aCl濃度對前發酵產蛋白酶的影響

2.4.aCl對前發酵產蛋白酶的影響

根據實驗方法1.2.5，前發酵不同NaCl濃度條件豆豉毛坯的蛋白酶活力為圖4。從圖4可知隨著NaCl溶液濃度的增加，豆豉毛坯的蛋白酶活力也相應的提高。當濃度達到0.6M時，蛋白酶活力最大，隨著NaCl溶液濃度的進一步增加，蛋白酶活力急劇下降。可能的原因是NaCl能在水中產生電離而成為激活劑，促進了毛霉菌株蛋白酶的合成代謝，并且可以使結合態的蛋白酶從菌絲體上游離出來，但NaCl濃度過高時，毛霉生長受到明顯的抑制，從而引起酶活的下降。

2.5.芽處理對前發酵產蛋白酶的影響

根據實驗方法1.2.6， 不同發芽處理后，豆豉前發酵毛坯蛋白酶活力結果見表2。

表2.源酶處理對豆豉前發酵的影響

由表2可知，內源酶處理能提高豆豉毛坯的蛋白酶活力,45℃處理6h毛坯的蛋白酶活力達到最大值。黃豆發芽過程中，由于分解酶和合成酶的作用，同時進行分解和和合成的代謝，當分解代謝占優勢時，能提高熟化大豆內的游離氨基酸、可溶性總糖及活性微量元素的含量，這有利于毛霉的生長和產蛋白酶；而當合成代謝占優勢時，游離活性成分的減少，毛霉的生長和產酶可能受到影響。鑒于生產周期和成本的考慮，45℃處理2h是最佳選擇。

2.6.豉前發酵條件的正交試驗

選擇前發酵時間（A）、NaCl濃度（B）、內源酶作用溫度（C）和內源酶作用時間（D）為試驗因素，設置三個水平，采用L9（43）正交表進行正交試驗，試驗結果列于表4。從表4的試驗結果可看出，豆豉前發酵不同條件對豆豉后發酵產品的氨基態含量、還原糖的含量及產品的硬度都有明顯的影響，其中內源酶作用溫度對豆豉產品三個指標的極差值影響最大的，而其它因素的影響對不同的指標有差異，其原因可能是適宜的內源作用溫度最利于大豆物質的分解，形成小分子物質，進一步促進了豆豉后發酵過程中毛霉酶系對物質的分解，從而增加了產品氨基態氮的含量，降低了產品的硬度。影響產品各指標的因素主次順序見表5所示。

表4.發酵正交試驗L9（43）的結果

K10.4450.4460.4190.433 K20.4420.4400.4420.446 K30.4460.4470.4720.454Σ=4還原糖的含量（%）R0.0040.0070.0530.021優水平A3B3C3D3 K11.111.010.841.03 K20.971.001.070.97 K30.880.931.030.94Σ=8.85產品的硬度（N）R0.230.080.230.09優水平A3B3C1D3表5 各指標的極差分析試驗指標主次順序氨基態氮的含量（%）CABD還原糖的含量（%）CDBA產品的硬度（N）CABD

以產品的氨基態氮的含量和產品的硬度為指標分析時，各因素的影響是一致的，且產品的鮮味和質地對風味的影響大，而產品還原糖的含量僅對風味有一定的調和作用，不是主要影響因素，故選擇豆豉前發酵最佳條件為：A3B3C1D3，即前發酵時間55h ，NaCl濃度0.6M，內源酶作用溫度為40℃，時間為2.5 h。

3. 論

綜上所述，影響豆豉前發酵的因素有多個，較為適宜的前發酵條件為溫度25℃，pH5～6之間，NaCl濃度0.6M，前發酵時間在55h，大豆經過發芽內源酶處理也有利于豆豉毛坯的蛋白酶積累和氨基態氮的提高，適宜的作用條件為浸泡大豆30℃發芽處理6h，40℃酶解2.5h。提高豆豉前發酵蛋白酶的活力，有利于豆豉后發酵期蛋白質的分解，改善了成品的品質和風味。

[1]鄔玉香,夏延斌,劉愛玲.大豆異黃酮在豆豉生產中的穩定性[J].湖南農業大學學報,2002（3）:237-238.

[2]蔣立文,周傳云,鄔玉香.傳統美食豆豉工業化生產的研究[J].食品科學,2003(3):59-64.

[3]錢存柔,黃儀秀. 微生物學實驗教程[M].北京:北京大學出版社,2000.

[4]姜錫瑞.酶制劑應用手冊[M].北京:中國輕工業出版社,2001.

[5]王瑞芝,杜曉湘.中國腐乳釀造[M].北京:中國輕工業出版社,1998.

[6]李遠志,鄭素霞, 羅樹燦等.真空微波加工馬鈴薯脆片的工藝特性[J].食品與發酵工業,2003,29(8):40-43.