柑桔萜油抑菌活性的研究

李雪玲，郭 麗

（安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽合肥230036）

柑桔萜油抑菌活性的研究

李雪玲，郭 麗

（安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽合肥230036）

采用濾紙片法測定了柑桔萜油對食品中常見的幾種腐敗致病菌的抑菌實驗，并研究了pH和高溫處理對柑桔萜油抑菌活性的影響。結果表明，柑桔萜油具有廣譜的抗菌范圍，尤其對霉菌抑制作用更為顯著。柑桔萜油抑菌活性的pH作用范圍為5～9，并且熱穩定性強。

柑桔萜油，抑菌活性

柑桔是蕓香科柑桔亞科的一種植物，共有六個屬［1］。我國民間就有用柑桔皮燒煙驅趕蚊蠅的作法，國內外已證實這主要是由柑桔皮中的柑桔油在起作用［2］，這說明柑桔油具有很好的殺菌作用。而有關這方面的研究未見報道。近年研究表明，柑桔油生物活性的有效成分是其中的萜油（主要是d-檸檬烯），萜油是柑桔精油脫萜生產中大量廢棄的副產物［3］。因此，本實驗對柑桔萜油的抑菌作用進行了初步的研究，希望能夠充分利用這些廢棄的萜油開發出一種天然防腐劑，為柑桔的綜合利用開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮柑桔皮；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、黑曲霉（Aspergillum niger）、青霉（Penicillium sp）、根霉（Rhizopus sp）、毛霉（Mucor）、假絲酵母（Saccharomyces cerevisiae）、澳大利亞酵母（Saccharomyces australia）、葡萄酒酵母（S.ellipoideus）由本院微生物實驗室提供；牛肉膏蛋白胨培養基（細菌用） 牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（霉菌用） 馬鈴薯300.0g、葡萄糖20.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL，pH自然；麥芽汁培養基（酵母用） 葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母膏10.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL，pH自然；95%乙醇，石油醚，丙三醇，NaOH，HCl，Ca2CO3，Na2SO4，金屬鈉，含鋅粉的乙醇液，溴水等。

YXQ-SG41-280型高壓蒸汽滅菌鍋，PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養箱，RE52CS型旋轉蒸發器，HH-S11-2型電熱恒溫水浴鍋，BS200S型電子分析天平，HS-1300-U型無菌操作臺，721分光光度計，pHS-3C型數字式酸度計，冰箱等。

1.2 實驗方法

1.2.1 柑桔萜油的制備

1.2.2 供試菌株的制備［4］在無菌室中將供試菌種接入相對應的試管斜面培養基上。細菌置35～37℃培養18～24h，霉菌在28℃，培養48h；酵母菌置30℃，培養24h，培養完之后放置0～4℃冷藏備用。

1.2.3 培養基平板制備［4］將配制好的各種菌種培養基高壓蒸汽滅菌后，冷卻至50～60℃，在無菌操作條件下將培養基傾注于高壓滅菌后的無菌培養皿內，每皿15～20mL，放平至培養基凝固。

1.2.4 菌懸液制備［4］取活化培養好的菌株，用接種環分別挑取少量細菌、霉菌孢子和酵母菌體，各放入9mL無菌生理鹽水中，搖勻，制成孢子、菌體懸浮液，使菌懸液中細菌數為1～2×108個/mL、霉菌孢子數為1～8×106個/mL、酵母菌數為1～7×106個/mL。

1.2.5 濾紙片法［5］取直徑8mm的滅菌濾紙片放入柑桔萜油原液中浸泡24h。將各種待試菌懸液各取0.5mL與相應固體培養基制成含菌平板，用無菌鑷子取含有柑桔萜油的濾紙片貼在固體平板上，每菌做3次重復。細菌置35～37℃培養18～24h，霉菌在28℃，培養48h，酵母菌置30℃，培養24h后觀察，選取抑菌圈比較明顯的平板測定抑菌圈直徑，結果取3次重復實驗的平均值。

1.2.6 柑桔萜油最低抑菌濃度（MIC）的測定 采用平板擴散法［6］，分別將柑桔萜油原液用丙三醇倍比稀釋，加入培養基中，用平板劃線法接種，細菌置35～37℃培養18～24h，霉菌在28℃，培養48h；酵母菌置30℃，培養24h，以無菌水、空白提取液及提取物稀釋劑丙三醇作對照，以完全沒有菌生長的最低提取物濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

1.2.7 不同外界條件對柑桔萜油抑菌活性的影響

1.2.7.1 pH對柑桔萜油抑菌活性的影響［7］分別用蒸餾水和柑桔萜油配制霉菌培養基，分裝試管，以2mol/L的NaOH和HCl分別配成2份pH3～9的系列培養基，用蒸餾水配制的稱為S1、S2，用柑桔萜油配制的稱為S3、S4。四份培養基均不滅菌，S1、S3放入冰箱冷藏，S2、S4放入28℃恒溫箱培養。以S1、S3作為對照（吸光度A=0），在分光光度計上分別測定相應pH下的吸光度A值。

1.2.7.2 高溫處理對柑桔萜油抑菌作用的影響［8］用柑桔萜油提取物代替蒸餾水配制成固體培養基，并在121℃條件下進行濕熱滅菌，然后接種四種常見霉菌，28℃條件下培養2d以上，觀察生長情況，以用蒸餾水配制的相應培養基作對照。

2 結果與分析

2.1 柑桔萜油的抑菌效果

柑桔萜油對供試菌抑菌效果見表1所示。抗菌素抑菌圈實驗結果的標準是：抑菌圈直徑＞15mm為最敏感、10～15mm為中度敏感，7～9mm為低度敏感，無抑菌者為不敏感［8］。

從表1可以看出，柑桔萜油對各種供試菌都有一定的抑菌作用。但相比較而言，柑桔萜油對霉菌和酵母菌的抑制作用要明顯大于對細菌的抑制作用，尤其是對根霉、毛霉和青霉的抑菌圈達到14.5mm，抑制作用最強；對葡萄酒酵母、澳大利亞酵母、黑曲霉抑菌圈也達到14.0mm，抑菌效果明顯；而對細菌也有一定的抑制作用，但效果不太明顯。

表1 柑桔萜油對供試菌的抑菌圈直徑

2.2 柑桔萜油最低抑菌濃度的測定結果

表2 柑桔萜油提取液濃度對供試菌抑菌效力的影響

見表2。表2表明，柑桔萜油對枯草芽孢桿菌的MIC為100mg/mL，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為50mg/mL，對假絲酵母的MIC為3.125mg/mL，對澳大利亞酵母和葡萄酒酵母的MIC為1.563mg/mL，對根霉、黑曲霉、毛霉和青霉的MIC為0.782mg/mL。

2.3 pH對柑桔萜油抑菌活性的影響

濾紙片法的測定結果表明，柑桔萜油對霉菌的抑菌效果更為明顯，所以本實驗選用毛霉為對象菌，研究pH對柑桔萜油抑菌活性的影響。表3列出了毛霉培養1周后S2、S4 pH系列培養物的吸光度A值，其空白對照分別為S1、S3。

表3 不同pH培養物的吸光度值

由表3可以看出，用柑桔萜油配制的霉菌培養基S4中雜菌生長濃度（渾濁度）明顯低于用蒸餾水配制的霉菌培養基S2，這表明柑桔萜油在pH5～9均有一定抑菌活性，并且柑桔萜油在酸性條件下抑菌活性明顯強于中性。

2.4 高溫處理對柑桔萜油抑菌作用的影響

本實驗選用霉菌為對象菌，研究高溫處理對柑桔萜油抑菌作用的影響，實驗結果見表4。

表4 霉菌在經121℃處理的蒸餾水、未高溫滅菌和高溫滅菌柑桔萜油馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中的生長情況

表4可以看出，蒸餾水培養基中的霉菌生長情況都很好，而在高溫滅菌柑桔萜油培養基中毛霉、青霉和根霉全無生長，黑曲霉有少量菌體生長。說明柑桔萜油經過121℃的高溫處理，其抑菌效果并未受到太大影響，這表明柑桔萜油具有良好的熱穩定性。

3 結論

柑桔萜油對大多數真菌類均有良好的抑菌作用，尤其是對霉菌極為顯著，而且所需的MIC較低，pH作用范圍廣、熱穩定性強。相比較而言，柑桔萜油對細菌則無明顯的抑制作用。

在食品加工中，熱處理工藝非常普遍，本研究結果顯示柑桔萜油具有很好的熱穩定性，這就給柑桔萜油在食品工業中的應用提供了基本的理論依據，也預示著柑桔萜油在食品工業中將有著較為廣泛的發展前景。因此，對柑桔萜油進行分離、純化，進而開發成一種天然防腐劑，是本實驗下一步有待開展的工作，其具有一定的社會效益和經濟效益。

［1］程紹南.柑桔對人體的生理調節機能［J］.中國柑桔，1994（1）：18-20.

［2］孫凌峰，劉秀娟，葉文峰，等.柑桔油和芋烯的性質及制取方法［J］.林產化工通訊，2000（6）：19-23.

［3］李于善，賀艷，鄧靜，等.柑桔精油中d-芋烯的轉化研究［J］.香料香精化妝品，2004（5）：10-12.

［4］楊海燕，郭麗，傅力.辣椒堿的抗菌研究［J］.新疆農業大學學報，2004（4）：63-66.

［5］吳周和，劉建成，吳小剛.藿香中天然防腐劑的提取方法及其抑菌作用研究［J］.中國調味品，2004（8）：18-20.

［6］樊黎生.蘆薈汁抗菌作用研究［J］.食品與發酵工業，2001（8）：38-40.

［7］李學紅，馬慶一，彭雪萍.香辛料抑菌活性研究及其在草莓保鮮中的應用［J］.食品研究與開發，2003（1）：96-99.

［8］顧仁勇，張麗，傅偉昌，等.芭蕉汁的抑菌作用［J］.食品與發酵工業，2005（3）：57-59.

Study on the bacteriostasis of d-limonene

LI Xue-ling，GUO Li
（College of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Bacteriostasis experimentation causing by d-limonene acting on some main spoilage organisms in food were determined by means of filter paper，and confirmed its MlC acting on these microorganisms，and the influences of pH and high temperature on d-limonene bacteriostasis were also studied.The results showed that dlimonene was a broad-spectrum antimicrobial，especially to fungus.ln addition，as to d-limonene bacteriostasis，the range of active pH was 5～9 for spoilage organisms in food and d-limonene had strong heat stability.

d-limonene；bacteriostasis

TS255.1

A

1002-0306（2010）12-0080-03

2009-09-16

李雪玲（1972-），女，講師，主要從事天然產物分離純化及功能性的研究。

安徽省農產品安全重點實驗室開放基金項目（las200503）。