介孔分子篩SBA-16固定化木瓜蛋白酶性質的研究*

孫偉杰，王素艷，谷桂娜，劉春艷

（遼寧師范大學化學化工學院，遼寧大連116029）

介孔分子篩SBA-16固定化木瓜蛋白酶性質的研究*

孫偉杰，王素艷，谷桂娜，劉春艷

（遼寧師范大學化學化工學院，遼寧大連116029）

以介孔分子篩SBA-16為載體采用物理吸附的方法對木瓜蛋白酶進行了固定化，研究了固定化條件對酶的相對活性的影響及在不同pH值下游離酶和固載酶的pH穩定性。實驗結果表明當1 g載體的給酶量為30 mg，固定化時間為2.5 h，pH值為7.0時，固定化木瓜蛋白酶的相對活性最好。與游離酶相比，固定化酶的pH穩定性有明顯改善。

SBA-16分子篩；固定化；木瓜蛋白酶；相對活性

木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，因其作用溫和、特異性強，在食品、醫藥等工業領域中應用廣泛[1-2]。然而游離的木瓜蛋白酶pH穩定性差，在溶液中易發生自解，因此使用效率很低。與游離酶相比，固定化酶具有很好的pH穩定性，正逐步受到國內外研究人士的重視。例如，北京化工大學的肖寧等[3]采用戊二醛作為交聯劑，MCM-41為載體固載木瓜蛋白酶；北京化工大學趙炳超等[4]以MCM-48為載體，戊二醛作交聯劑對木瓜蛋白酶進行了固定化研究等均已見報道。他們采用的固載方法為共價交聯法，該方法的優點是酶與載體之間的連接很牢固，穩定性好，但反應條件激烈，操作復雜，得到的固定化酶的活性較低。物理吸附的方法操作簡單，反應條件溫和，載體可反復使用[5]，有利于保持酶分子的結構和性能，從而有效克服了交聯法對酶性能的干擾。這方面的研究在國外已經開始，例如，Diaz等[6]曾經采用MCM-41作為載體，進行了直接吸附木瓜蛋白酶的研究，并取得了一定效果。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

SBA-16分子篩（實驗室自制）、木瓜蛋白酶（Sigma公司）、酪蛋白（Sigma公司）、酪氨酸（Sigma公司）；鹽酸半胱氨酸、EDTA、三氯醋酸以及配制緩沖溶液（0.1 mol/L的鈉鹽）所用的磷酸鹽等，均為分析純。

1.2 固定化木瓜蛋白酶的制備

將1 g的SBA-16粉末和3 mL，pH為7.0的磷酸緩沖溶液加入25 mL的錐形瓶內，然后再加入5 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液1 mL。固定化反應在溫度為20℃，攪拌速度為180 r/min的條件下進行2 h，過濾，洗滌，自然干燥，即得到固定化木瓜蛋白酶。

1.3 游離及固定化木瓜蛋白酶活性的測定[7]

木瓜蛋白酶的活性是以酪蛋白作底物、酪氨酸作標準物用紫外方法測量。具體操作如下：精密量取酪蛋白溶液3 mL，加入5 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液1 mL和2 mL的激活劑，搖勻，置40℃水浴中，酶解20 min，加入3 mL三氯醋酸溶液終止酶解反應，過濾，濾液稀釋20倍作供試液。上述條件，先加三氯醋酸，再加木瓜蛋白酶溶液置40℃水浴中放置20 min，過濾，濾液稀釋20倍作空白溶液。以0.1 mol/L鹽酸溶液作空白，酪氨酸為對照品，在275 nm波長處測定空白溶液、供試液和對照品溶液的吸光度。

式中：A—供試液的吸光度減去空白溶液的吸光度；

As—酪氨酸對照品溶液的吸光度；

Cs—酪氨酸對照品溶液的質量濃度，μg/mL；

W—樣品質量，mg。

相對活性指以同組實驗中活性最大值為100%其它實驗點值與該點進行比較。

2 結果與討論

2.1 SBA-16分子篩和固定化木瓜蛋白酶的表征

圖1為SBA-16分子篩和固定化酶的XRD圖。

2種樣品的XRD圖均具有SBA-16分子篩典型的特征衍射峰，這與文獻[7]報道的純硅SBA-16圖一致。從圖1可知固定化酶的XRD圖中2θ要比SBA-16分子篩的大，說明酶進入SBA-16分子篩的孔徑內，使載體的孔徑變小，但并沒有破壞SBA-16分子篩的框架結構。

2.2 固定化條件對固定化酶活性的影響

2.2.1 固定化時間的影響

采用不同的固定化時間，制得的固定化酶的相對活性見圖2。

從圖2可以看出，隨著固載時間的增加，固定化酶的相對活性先增加后降低，其原因可能是：（1）隨著攪拌時間的延長，進入載體孔道內的酶量增加，固定化酶的相對活性升高；（2）木瓜蛋白酶分子停留在載體孔口，使另一部分酶分子需要克服擴散阻力才能進入到載體的孔道內部，并且已經固定上的酶由于受到載體的影響可能變性失活[3]，使得固定化酶的相對活性開始降低。因此，固定化木瓜蛋白酶的最佳攪拌時間為2.5 h。

2.2.2 給酶量的影響

體積一定，濃度不同的木瓜蛋白酶溶液，在相同的固定化時間2 h內制得的固定化酶的相對活性見圖3。

由圖可知，當1 g載體的給酶量達到30 mg時，固定化酶的相對活性最高，繼續增加給酶量，固定化酶的活性緩慢下降。在攪拌時間一定的條件下，隨著給酶濃度的增加，載體對木瓜蛋白酶的吸附逐漸達到最大吸附，固定化酶的相對活性也達到最大值。固載上的酶易脫落或發生變性而使固定化酶的相對活性緩慢下降。

2.2.3 pH對固定化的影響

用相同體積，不同pH值的磷酸緩沖溶液制得的固定化酶的相對活性見圖4。

從圖4可以看出，固載后的木瓜蛋白酶在pH值為7.0左右相對活性最大，原因可能是：酶在酸堿性的溶液中，極易失活，導致固定化酶的活性降低。

2.3 固定化酶的pH穩定性

取等量游離木瓜蛋白酶及上述最佳條件下制得的固定化木瓜蛋白酶分別放在不同pH值的磷酸緩沖溶液中，靜置24 h。得出游離酶及固定化酶的相對活性如圖5所示。

從圖5可以看出，在pH 5.8～7.8的范圍內，固定化酶的pH穩定性范圍比游離酶更寬。因為SBA-16表面富含羥基，這些羥基可以對分子篩孔道中溶液的pH值起一定的緩沖作用，從而使孔道內溶液的pH變化范圍小于磷酸緩沖溶液的pH變化范圍，這很可能是固定化木瓜蛋白酶pH穩定性提高的一個重要的原因[8]。

3 結論

本文采用物理吸附的方法，以SBA-16分子篩做載體固定化木瓜蛋白酶。實驗結果表明當1 g的 SBA-16分子篩載體在pH值為7.0的磷酸緩沖溶液中，給酶量為30 mg，固定化時間為2.5 h時，固定化木瓜蛋白酶的相對活性最好。與游離酶相比，固定化酶的pH穩定性有明顯提高。因此，SBA-16分子篩可以作為一種固載木瓜蛋白酶新的載體。

[1]趙元藩，丁認全.木瓜蛋白酶的加工工藝及應[J].云南師范大學學報，1999，19（5）：15-17.

[2]乙引，陳平，王茜.木瓜蛋白酶改良啤酒品質的研究[J].貴州農業科學，2000，28（4）：14-16.

[3]肖寧，趙炳超，王艷輝.介孔分子篩MCM-41固定化木瓜蛋白酶的研究[J].北京化工大學學報，2005，32（4）：41-43.

[4]趙炳超，馬潤宇，石波.介孔分子篩MCM-48固定化木瓜蛋白酶性質的研究[J].食品與發酵工業，2005，31（10）：60-63.

[5]陳靜.介孔材料固定酶的性質和穩定性研究[D].長春：吉林大學，2005.

[6]Felipe J，Diaz，kenneth J，et al.Enzyme immobilized in MCM-41 molecular sieve[J].Journal of Molecular Catalysis B，Enzymatic，1996（2）：115-126.

[7]羅遠秀.木瓜酶活力測定方法的研究[J].廣西藥品檢驗所，2000，35（8）：556-558.

[8]趙麗芳.脂肪酶的固定化及其催化性能的研究[D].長春：吉林大學，2008.

Immobilization of Papain on Mesoporous Molecular Sieve SBA-16

SUN Wei-jie，WANG Su-yan，GU Gui-na，LIU Chun-yan

（College of Chemistry and Chemical Engineering，Liaoning Normal University，Liaoning Dalian 116029，China）

Papain was immobilized on the mesoporous molecular sieve SBA-16 by physical adsorption method.The effects of immobilization conditions on the relative activity of the papain were studied.At the same time，the pH stability of the free enzyme and immobilized enzyme was discussed at different pH values.Experimental results show that the optimum conditions for immobilization are as follows:concentration of the free enzyme，time，and pH are 30 mg/g，2.5 h and 7.0，respectively.Compared with the free enzyme，pH-stability of immobilized papain has also been improved.

Molecular sieve SBA-16；Immobilized；Papain；Relative activity

TQ925+.2

A

1671-0460（2010）02-0129-03

2010-03-03

孫偉杰（1983-），女，碩士研究生。

劉春艷（1971-），女，副教授，研究方向為介孔材料的制備與應用。E-mail:lcybeauty@163.com。