響應面法優(yōu)化紅曲霉 X27液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸工藝條件

葉 硯 蔣冬花 嵇 豪

(浙江師范大學化學與生命科學學院,金華 321004)

響應面法優(yōu)化紅曲霉 X27液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸工藝條件

葉 硯 蔣冬花 嵇 豪

(浙江師范大學化學與生命科學學院,金華 321004)

基于 P-B法試驗的結(jié)果,利用響應面法對紅曲霉菌株X27液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸(GABA)的工藝條件進行了優(yōu)化。Plackett-Burman法確定了紅曲霉 X27液體發(fā)酵產(chǎn) GABA的三個主要的影響因素(溫度,pH和通氣量);然后利用響應面分析方法,確定其最優(yōu)工藝條件為:34℃,pH 5.5,通氣量 120 L/h,其 GA2 BA產(chǎn)量可達 9.18 g/L。

紅曲霉 GABA Plackett-Bur man法 響應面法 液態(tài)發(fā)酵

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid,GABA)是一種廣泛分布于細菌、真菌、藻類和動植物中的非蛋白質(zhì)氨基酸[1]。研究表明:GABA具有抗焦慮、抗驚厥、降血壓、改善腦機能、促進長期記憶、增加神經(jīng)營養(yǎng)、活化腎、肝功能等多種生理功能[2-4]。此外植物體內(nèi)的 GABA還參與抵御逆境脅迫反應等作用以及調(diào)節(jié)花粉管生長和植物生長方向的功能[5-6]。

紅曲在我國有著 1 000余年的使用歷史,它是一種以大米為原料,經(jīng)紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的一種紫紅色的獨特米曲,廣泛應用于食品工業(yè)和疾病治療,具有降血壓、降血脂等作用[7-8]。目前針對紅曲霉生物合成 GABA的研究大多采用固體發(fā)酵法。而深層發(fā)酵具有不易受雜菌污染,發(fā)酵中間過程調(diào)控方便的優(yōu)點,更有利于 GABA產(chǎn)量的提高[9]。采用已有的一株產(chǎn) GABA的紅曲霉 X27,利用 Plackett-Burman(P -B)試驗設計確定影響其液體發(fā)酵產(chǎn) GABA的三個主要因素,并進一步運用響應面法 (Response Surface Methodology,RS M)分析,確定了其產(chǎn) GABA的最優(yōu)生產(chǎn)條件[10]。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

紅色紅曲霉 (Monascus ruber)X27:浙江師范大學生物技術實驗室保存。

KLF200發(fā)酵罐:瑞士比歐生物工程公司;M IK2 RO 22R高速冷凍離心機:德國 Hettich公司;Agilent 1200液相色譜儀:Agilent科技公司。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

試管斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基;

種子培養(yǎng)液:馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,谷氨酸5 g,谷氨酸鈉 5 g,酵母浸膏 5 g,氯化鋅 1 g,硫酸鎂1 g,水 1 000 mL;

發(fā)酵培養(yǎng)液:葡萄糖 20 g,磷酸氫二鉀 1 g,磷酸二氫鉀 1 g,谷氨酸鈉 5 g,氯化鋅 1 g,硝酸鈉 5 g,硫酸鎂 1 g,硫酸亞鐵 0.01 g,水 1 000 mL。

培養(yǎng)方法:試管斜面接種后,在 30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7 d至菌絲長滿斜面。用 5 mL無菌水洗下斜面孢子,接入裝有 50 mL種子培養(yǎng)液的 250 mL錐形瓶中,30℃、200 r/min搖床培養(yǎng) 72 h。將培養(yǎng)好的一級種子液轉(zhuǎn)接入裝有 100 mL種子培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中[11],同樣條件下培養(yǎng) 48 h制成二級種子后,上罐發(fā)酵。

1.3 優(yōu)化試驗設計

利用統(tǒng)計分析軟件Minitab 15版進行試驗的設計和數(shù)據(jù)分析。

1.3.1 Plackett-Bur man試驗設計

采用Minitab 15軟件的 P-B試驗設計法,以溫度(X1),pH(X2),發(fā)酵罐罐壓 (X3),通氣量 (X4),接種量 (X5),攪拌槳轉(zhuǎn)速 (X6),種子級數(shù) (X7)作為試驗因子進行實驗設計,GABA濃度 (Y)為響應值,進行 7因子 2水平的 P-B設計,各因子的編碼水平和取值如表1所示。

表1 P-B試驗設計各因子編碼水平與取值表

根據(jù)表 1的編碼水平與取值,將數(shù)據(jù)輸入Minit2 ab 15運行 P-B試驗設計。

1.3.2 最陡爬坡試驗設計

最陡爬坡試驗以各顯著效應值的大小來確定最陡上升路徑,而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應的正負和大小,正效應的因素取較高值,負效應的因素取較低值。根據(jù) P-B試驗確定的影響 GABA發(fā)酵的主要因素,設計最陡爬坡試驗。

1.3.3 RS M試驗設計

根據(jù) P-B試驗設計的結(jié)果進行分析,將對 GA2 BA發(fā)酵影響最大的三個因素確定為主要因素,進行RS M試驗設計,采用Box-Behnken設計法進行響應面分析。根據(jù)所得結(jié)果建立回歸方程并描述各因子對響應值的影響。

通過對回歸方程的方差分析,評價每個因子及其交互作用對響應值的影響程度,并用響應面圖直觀地描繪結(jié)果,同時求出響應值最大時各因子的水平。

1.4 分析方法

GABA含量采用 HPLC進行檢測[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定影響紅曲 GABA產(chǎn)量的重要因子

表 2 Plackett-Burman設計試驗方案及結(jié)果

表 3 P-B試驗設計因素回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

除以上 3個顯著因素外,其他因素的變化對 GA2 BA的發(fā)酵產(chǎn)量影響不大,故后續(xù)試驗采用同一條件:一級種子,罐壓 0.3 MPa,接種量 5%,攪拌槳轉(zhuǎn)速 200 r/min。

2.2 最陡爬坡試驗

針對溫度、pH、通氣量 3個因素進行最陡爬坡試驗,其中溫度為正效應,pH和通氣量為負效應,將前者的值逐步增加,后兩者的值逐步減小以尋找最大響應區(qū)域[13]。試驗設計和結(jié)果如表 4所示。

表4 最陡爬坡試驗設計及試驗結(jié)果

由最陡爬坡試驗可知:在溫度32.5℃,pH 5.5和通氣量125 L/h的條件下 GABA產(chǎn)量最高,設定溫度32.5℃,pH 5.5和通氣量 125 L/h為 RS M試驗的中心點,據(jù)此設計RS M試驗。

2.3 RS M優(yōu)化發(fā)酵條件

2.3.1 回歸方程建立與方差分析

結(jié)合 2.1確定的影響 GABA產(chǎn)量的顯著因素及爬坡試驗結(jié)果,重新定義溫度、pH、通氣量分別為X1,X2,X3并進行 RS M試驗。同時根據(jù)效應值設計RS M試驗高低水平,見表 5。

表5 RS M試驗設計

運用Minitab 15軟件設計出 RS M試驗 (表 6),以 GABA的產(chǎn)量為響應值,將試驗結(jié)果輸入Minitab 15進行統(tǒng)計學分析,作出相應的圖標和數(shù)學模型,并根據(jù)圖表數(shù)據(jù)進行分析。從結(jié)果大體看出隨著溫度的升高 GABA合成量也在上升,pH的最佳范圍在5.5附近,通氣量的大小與 GABA產(chǎn)量呈反相關。

表 6 利用Minitab設計出的 RS M試驗項目及結(jié)果

從表6可見,當溫度為32.5℃,pH為5.5,通氣量125 L/h的情況下,G ABA的產(chǎn)量最高,為 9.18 g/L。

以 GABA產(chǎn)量為響應值進行分析后,Minitab 15給出的回歸系數(shù),建立回歸方程如下:

表7 回歸分析結(jié)果表

根據(jù)表 8的數(shù)據(jù)分析得出可知:失擬不足 (P= 0.213>0.05),而回歸方程的 P值小于 0.001,達到極顯著,數(shù)據(jù)分析的結(jié)果為:得 X1=34.29,X2= 5.50,X3=119.20,解值為 9.30。即當溫度為34.3℃,pH為5.5,通氣量為 119.2 L/h時,GABA的發(fā)酵值為9.30 g/L。

表8 方差分析表

2.3.2 響應面以及等高線分析結(jié)果

響應面圖是響應面在各試驗因子交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個三維空間曲面。根據(jù)回歸方程,采用Minitab 15軟件回執(zhí)響應面和等值線圖,考察所擬合的響應曲面的形狀[14]。圖 1～圖 3是對響應值G ABA影響最大的三個因素的交互作用的響應面。

圖1 GABA關于溫度與pH的響應面圖

由圖 1中可知,當溫度在 (30.0,34.3)區(qū)間,pH在(5.0,5.5)區(qū)間內(nèi),GABA的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高,呈現(xiàn)正相關。而當溫度在 (34.3,35.0)區(qū)間,pH在(5.5,6.0)區(qū)間內(nèi),GABA的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低,呈現(xiàn)負相關。

圖2 GABA關于溫度與通氣量的響應面圖

由圖 2可知,當溫度在 (30.0,34.3)區(qū)間,通氣量在(100.0,119.2)區(qū)間內(nèi),GABA的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高,與兩者呈現(xiàn)正相關。當溫度在(34.3,35.0)區(qū)間,通氣量在 (119.2,150.0)區(qū)間內(nèi), GABA的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低,呈現(xiàn)負相關。

圖3 GABA關于pH與通氣量的響應面圖

由圖 3可知,當 pH在(30.0,34.3)區(qū)間,通氣量在(100,119.2)區(qū)間內(nèi),GABA的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高,呈現(xiàn)正相關。而當 pH在 (34.3, 35.0)區(qū)間,通氣量在 (119.2,150.0)區(qū)間內(nèi),GABA單位產(chǎn)量隨著兩者的增高而降低,呈現(xiàn)負相關。

將試驗數(shù)據(jù)導入Minitab 15。可知最佳條件是:溫度為 34.3℃,pH為 5.5,通氣量在 119.2 L/h,此時紅曲菌 X27的 GABA產(chǎn)量最高,為 9.30 g/L。

2.3.3 驗證試驗

為驗證試驗的可靠性,采用上述最優(yōu)發(fā)酵條件進行 GABA發(fā)酵驗證試驗,考慮到實際操作的便利,將最佳條件修正為溫度 34℃,pH 5.5,通氣量為 120 L/h,經(jīng)測定,兩次平行試驗的 GABA生產(chǎn)量分別為9.16 g/L和 9.21 g/L,GABA平均產(chǎn)量為 9.18 g/L,實測平均值與預測值無顯著差別,證明此次 RS M試驗參數(shù)準確可靠,具有實用價值。

3 結(jié)論

Plackett-Burman法確定對紅曲菌液體發(fā)酵生產(chǎn) GABA影響重要的三個因素分別是溫度,pH和通氣量。響應面法優(yōu)化后的工藝條件為,34℃,pH 5.5,通氣量 120 L/h。優(yōu)化后的 GABA產(chǎn)量達到9.18 g/L,比未優(yōu)化提高 74.7%。

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Opti mization of Fer mentation Conditions of Monascus X27 for Producingγ2Aminobutyric Acid

Ye Yan Jiang Donghua Ji Hao
(College of Chemistry and Life Sciences,ZhejiangNo rmalUniversity,Jinhua 321004)

Based on the results of a Plackett-Burman design experi ment,showing the most significant influen2 cing factors in biosynthesis ofγ2aminobutyic acid were temperature,pH and ventilation rate,the response surface methodologywas used to optimize the liquid fer mentation conditions for producingγ2aminobutyric acid byM onascus ruberX27.Results:The optimized fermentation conditions for theγ2aminobutyric acid production are 34℃,pH 5.5 and 120 L/h.Under the conditions,the yield ofγ2aminobutyric acid is 9.18 g/L.

monascus,γ2aminobutyric acid,Plackett-Bur man design,response surface methodology,liquid fer mentation

Q939.97 文獻標識碼:A 文章編號:1003-0174(2010)09-0106-05

浙江省重大科技專項(2007C12036),浙江省自然科學基金(Y3090343)

2009-10-10

葉硯,男,1984年出生,碩士,應用微生物

蔣冬花,女,1964年出生,教授,微生物學與植物病理學