固定化熒光假單胞菌脂肪酶用于催化低酸值餐飲廢油的酯交換反應

楊建斌杜傳林徐振業滕家良

(上海中器環保科技有限公司1，上海 201419)

(國家糧食局科學研究院2，北京 100037)

固定化熒光假單胞菌脂肪酶用于催化低酸值餐飲廢油的酯交換反應

楊建斌1杜傳林2徐振業1滕家良1

(上海中器環保科技有限公司1，上海 201419)

(國家糧食局科學研究院2，北京 100037)

動植物油脂的酯交換反應是制備脂肪酸烷基酯的一個重要反應。其中，脂肪酸甲酯、乙酯為普通石化柴油的優質替代燃料。脂肪酶易于固定在海于連續生產生物柴油，試驗研究了一株商業熒光假單胞菌(P.fluorescens ATCC 13525)固定化脂肪酶催化低酸值餐飲廢油和甲醇合成生物柴油的最優工藝條件。通過對反應溫度、pH值、醇油物質的量比、酶的用量，反應時間等重要參數的研究，得到最優工藝條件:當反應溫度為40℃，pH 7.0，醇油物質的量比4∶1，酶用量為3.0 g，反應時間48 h，反應體系含水量為8%時，生物柴油的得率最高。所制備的產品經分析測試，完全可以替代普通石化柴油，而且對現有內燃機無需做任何改動。

酯交換反應 生物柴油 低酸值餐飲廢油 熒光假單胞菌脂肪酶

近年來，隨著石油資源的逐漸枯竭和人們對環保意識的不斷增強，一種以動植物油脂為原料合成的綠色環保型燃料——生物柴油，引起了世界各國越來越多的關注［1－3］。生物柴油是指利用三酰甘油或脂肪酸與短鏈醇(如甲醇)進行酯交換或酯化反應生成的長鏈脂肪酸單酰酯，商品化的生物柴油主要成分是脂肪酸甲酯。生物柴油與石油柴油相比，具有環保和可再生性兩個突出的優點，是一種新型的石化柴油的替代能源［4］。

目前工業化生產生物柴油的主要方法是化學催化法，該方法存在工藝復雜、能耗高、對原料品質要求高、產物難提純以及產生廢水的缺點［5］。酶法催化生產生物柴油具有反應條件溫和、對原料油脂品質沒有特別的要求、適應性廣、無皂化等副反應發生、產物易于分離純化和設備要求低等優點，是一種極具發展潛力的生物柴油生產方法［6－7］。一些研究者通過使用來自念珠菌種、假單胞菌種、根霉菌種的固定化脂肪酶催化醇解合成生物柴油。研究發現，用這些脂肪酶作為醇解催化劑，無論在高含水量還是低含水量的反應體系中，甲酯質量分數均在于90%以上［8］。

脂肪酶的價格較貴，需要復雜的回收、純化操作以及固定化過程，使用脂肪酶作為催化劑工業生產成本較高。因此，近年來應用全細胞生物催化劑的研究得到了發展，這種工藝無需復雜的提純過程，無游離脂肪酶或催化劑殘渣存在，節省了設備和運行維護費用。Foidl N等［9］研究了海藻酸鈉凝膠固定熒光假單胞菌脂肪酶作為全細胞生物催化劑用于催化合成生物柴油。本試驗研究一株商業熒光假單胞菌固定化脂肪酶催化低酸值餐飲廢油和甲醇合成生物柴油的最優工藝條件。

1 材料與方法

1.1 原料

低酸值餐飲廢油(密度 0.912 g/cm3，酸值17.45 mgKOH/g，皂化值187.0 mgKOH/g)，由上海市浦東新區某餐飲酒店提供。

1.2 儀器和試劑

RE52CS旋轉蒸發儀:上海亞榮生化儀器廠; 150A數顯生化培養箱:江蘇金壇市恒豐儀器制造有限公司;Agilent 6820氣相色譜儀:安捷倫科技有限公司。

月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯、花生酸甲酯均為色譜純，Sigma公司。

1.3 菌種

P.fluorescens ATCC 13525商業菌株:上海三踏生物科技有限公司。

1.4 培養基

液體種子培養基的組成(g/L):牛肉粉1.0，L酵母粉2.0，蛋白胨5.0，氯化鈉5.0。

營養瓊脂培養基的組成(g/L):蛋白胨10.0，氯化鈉5.0，牛肉浸出粉4.0，瓊脂15.0。

1.5 試驗方法

1.5.1 接種準備

將保藏的P.fluorescens ATCC 13525菌接種到營養瓊脂培養基，于25℃恒溫培養箱中活化培養3 d后，4℃條件下保藏。

1.5.2 菌種培養與收集

將新鮮長好的菌接種于250 mL液體種子培養基中，于25℃，200 r/min搖床中恒溫培養24 h后，以1 200 r/min離心5 min，收集濕菌體，然后用無菌水洗滌2次得到活性菌體細胞。

1.5.3 海藻酸鈉凝膠包埋熒光假單胞菌

①取濃度為0.5%～10.0%海藻酸鈉凝膠溶于沸水中，121℃高壓滅菌15 min;②將海藻酸鈉溶液與菌體細胞懸浮物混合均勻，使海藻酸鈉最終濃度為2.0%～4.0%;③將海藻酸鈉與菌體細胞混合液用針形管滴入5.0%～10.0%的無菌CaCl2溶液中，在4℃固定24 h;④濾出已固定好的脂肪酶凝膠顆粒，用生理鹽水(或純凈水)洗去剩余的鈣離子及未包埋的細胞;⑤干燥后備用，不用時可浸入0.9%氯化鈉溶液保藏于4℃冰箱中。

1.5.4 低酸值餐飲廢油的酯交換反應

將低酸值餐飲廢油與甲醇按照一定的醇油物質的量比置于100 mL具塞搖瓶中，加入一定量的固定化脂肪酶，混合均勻。另在反應體系中加入一定量的正己烷來提高反應物的溶解度［10］，加入一定量的蒸餾水，加熱到反應溫度于恒定轉速(150 r/min，振幅70 mm)的搖床中恒溫反應48 h。48 h后采用過濾的方法除去反應體系的固定化脂肪酶，產品甲酯和副產品甘油用分液漏斗靜置分離。通過改變反應體系的溫度、pH值、反應時間、固定化脂肪酶的加入量、醇油物質的量比，反應體系含水量，重復進行酯交換反應。

2 結果與討論

2.1 溫度的影響

反應溫度是生物柴油得率的一個重要參數，因反應溫度會嚴重影響酯交換反應進行的速率。在反應體系中加入50 mL低酸值餐飲廢油和一定量的甲醇(醇油物質的量比為4∶1，并加入3 mL正己烷溶劑)，3.0 g固定化脂肪酶，反應體系pH值保持7.0，反應體系含水量為8%，反應時間48 h，通過改變反應溫度來研究固定化脂肪酶催化低酸值餐飲廢油合成生物柴油的影響，不同反應溫度下生物柴油的得率如圖1所示。

圖1 不同反應溫度對生物柴油得率的影響

從圖1可以看出，反應溫度對生物柴油得率的影響較為明顯，隨著反應溫度的上升，生物柴油得率也不斷升高，當反應溫度為40℃時，生物柴油得率達到最高90%。當反應溫度大于40℃時，由于高溫下酶的活性降低，得率又逐漸開始下降。所以生物柴油最高得率的最適溫度為40℃。

2.2 反應體系pH值的影響

反應體系的pH值也是影響生物柴油得率的一個重要參數，脂肪酸甲酯的得率隨反應體系pH值的變化而變化。在反應體系中加入50 mL低酸值餐飲廢油和一定量的甲醇(醇油物質的量比為4∶1，并加入3 mL正己烷溶劑)，3.0 g固定化脂肪酶，反應溫度40℃，反應體系含水量為8%，反應時間48 h，通過改變反應體系的pH值來研究固定化脂肪酶催化低酸值餐飲廢油合成生物柴油的影響。隨著反應體系的pH值在5.5～7.5內變化，生物柴油的得率如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著pH值從5.5上升到7.0時，生物柴油的得率也達到了一個最大值91%，當pH值大于7.0時，生物柴油得率又逐漸下降。因此，在反應體系中生物柴油最高得率的最適 pH值為7.0。

圖2 反應體系pH值對生物柴油得率的影響

2.3 反應時間的影響

在反應體系中加入50 mL低酸值餐飲廢油和一定量的甲醇(醇油物質的量比為4∶1，并加入3 mL正己烷溶劑)，3.0 g固定化脂肪酶，反應體系pH 7.0，反應溫度40℃，反應體系含水量為8%，通過改變反應時間來研究固定化脂肪酶催化低酸值餐飲廢油合成生物柴油的影響，在不同反應時間內(12、24、36、48、60)生物柴油得率的變化如圖3所示。

圖3 不同反應時間對生物柴油得率的影響

從圖3可以看出，隨著反應時間的增加，生物柴油得率也逐漸提高，當反應時間達到48 h時，繼續增加反應的時間，生物柴油得率不會有明顯的提高。故固定化脂肪酶催化低酸值餐飲廢油合成生物柴油的最佳反應時間為48 h。

2.4 加酶量的影響

在反應體系中加入50 mL低酸值餐飲廢油和一定量的甲醇(醇油物質的量比為4∶1，并加入3 mL正己烷溶劑)，反應體系 pH值保持7.0，反應溫度40℃，反應時間48 h，反應體系含水量為8%，通過改變加入固定化脂肪酶的量來研究酶催化低酸值餐飲廢油合成生物柴油得率的影響。當加入不同用量(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g)的固定化脂肪酶，生物柴油得率的變化如圖4所示。

從圖4可以看出，隨著固定化脂肪酶用量的增加，生物柴油得率也逐漸提高，當加入固定化脂肪酶的量為3.0 g時，生物柴油的得率達到最高。隨后繼續增加脂肪酶的用量，得率反而會下降。所以固定化脂肪酶的最適用量為3.0 g。

圖4 加酶量對生物柴油得率的影響

2.5 醇油物質的量比的影響

影響生物柴油得率的另外一個重要變量就是反應體系的醇油物質的量比。因為反應體系中醇油物質的量比可以改變酯交換反應進行的方向，所以在酯交換反應過程中需要加入過量的甲醇或及時移除反應生成產物，使得酯交換反應向正反應方向進行。

在反應體系中加入50 mL低酸值餐飲廢油，加入3 mL正己烷溶劑，保持反應溫度40℃，反應時間48 h，加入3.0 g固定化脂肪酶，反應體系pH值7.0，反應體系含水量為8%，通過加入不同醇油物質的量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)的甲醇來研究固定化脂肪酶催化低酸值餐飲廢油合成生物柴油得率的影響，如圖5所示。

圖5 醇油物質的量比對生物柴油得率的影響

從圖5可以看出，隨著醇油物質的量比的不斷增加，發現生物柴油的得率也在不斷提高，當生物柴油的得率達到最高值91%，此時的醇油物質的量比為4∶1。當醇油物質的量比大于4∶1時，生物柴油的得率又不斷下降。這是由于太過量甲醇對脂肪酶的強烈抑制作用，導致酶中毒使酶活性降低。

2.6 反應體系含水量的影響

脂肪酶只有在油－水界面才具有催化活性，因此水在反應體系中是必不可少的，但過多的水會促進脂肪酶催化底物水解而不是發生酯交換反應。采用醇油物質的量比為4∶1，反應溫度40℃，固定化脂肪酶用量為3.0 g，pH 7.0，反應時間為48 h，反應體系不同含水量(2%、4%、6%、8%、10%)對生物柴油得率的影響如圖6所示。

圖6 反應體系含水量對生物柴油得率的影響

從圖6可以看出，脂肪酶的活力隨著反應體系含水量的增加而急劇增大，當反應體系含水量高于8%時，生物柴油得率呈逐漸降低趨勢，表明過量的水會使反應向水解方向進行，從而在一定程度上影響酯交換反應的轉化率。

2.7 甲酯含量的確定

在反應體系中，采用醇油物質的量比為4∶1，反應溫度40℃，反應時間為48 h，反應體系含水量為8%，固定化脂肪酶用量為3.0 g，pH 7.0，所生成的產品甲酯經過處理后按照GC分析的方法進行分析，得到的GC色譜圖如圖7所示，GC色譜分析數據如表1所示，甲酯質量分數為91.771 9%。

圖7 產品甲酯的GC色譜圖

表1 GC色譜分析數據

3 結論

通過試驗研究，商業菌株 P.fluorescens ATCC 13525固定化脂肪酶用于催化低酸值餐飲廢油和甲醇合成生物柴油的最優工藝條件是:在反應體系中，醇油物質的量比為4∶1，反應最適溫度為40℃，反應時間為48 h，固定化脂肪酶3.0 g，pH 7.0，反應體系含水量為8%，生物柴油得率可達到91%。所生成的產品通過GC分析，從圖6及表1可以得出，甲酯質量分數為91.771 9%。

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Transesterification of Low Acid Value Waste Oil from Restaurant Using Immobilized Pseudomonas fluorescens Lipase

Yang Jianbin1Du Chuanlin2Xu Zhenye1Teng Jialiang1
(Shanghai Zhongqi Environment Technology Co.Ltd1，Shanghai201419)
(Academy of State Administration of Grain2，Beijing 100037)

Transesterification of vegetable/animal oils is an important reaction to produce methyl and ethyl esters as substitutes for diesel fuel.P.fluorescens lipase is easily immobilized within sodium alginate for continuous production.The optimum conditions of synthesis of biodiesel from low acid value(LAV)restaurant waste oil and methanol catalyzed by a commercial immobilized lipase from P.fluorescens ATCC 13525 have been studied.The important parameters like reaction temperature，pH，methanol/oil molar ratio，enzyme dosage and reaction time were studied.Results:The maximum yield of biodiesel can be obtained at the optimum conditions of molar ratio 4∶1，water content 8%，enzyme dosage 3.0 g，pH 7.0，reaction temperature 40℃，and reaction time 48 h.The products were compared with conventional petroleum based diesel and it was found that the product could be used as an effective alternate fuel in existing diesel engine without any hardware engine modification.

transesterification，biodiesel，low acid value waste oil from restaurant，P.fluorescens lipase

文獻標識碼:A 文章編號:1003－0174(2010)11－0069－05

上海市高新技術成果轉化項目(201001057)

2010－01－21

楊建斌，男，1981年出生，碩士，生物柴油技術