刺糖多孢菌生長特性及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

李 麗羅莉斯王艷萍李能威郭偉群王潔穎張曉琳

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院1，天津 300457)

(國家糧食局科學(xué)研究院2，北京 100037)

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3，貴州 550025)

刺糖多孢菌生長特性及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

李 麗1，2羅莉斯2，3王艷萍1李能威2郭偉群2王潔穎1，2張曉琳2

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院1，天津 300457)

(國家糧食局科學(xué)研究院2，北京 100037)

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3，貴州 550025)

研究了多殺菌素生產(chǎn)菌株的生長特性及種子培養(yǎng)條件對其發(fā)酵產(chǎn)量的影響。采用單因素試驗確定刺糖多孢菌C3－10－4的最優(yōu)種子培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)溫度，同時采用正交設(shè)計對刺糖多孢菌C3－10－4培養(yǎng)基裝量、搖床轉(zhuǎn)速和添加玻璃珠個數(shù)進行了優(yōu)化，并運用Gompertz模型擬合其生長曲線。結(jié)果表明:最佳種子培養(yǎng)基為:胰蛋白酶大豆肉湯30 g、酵母提取物3 g、硫酸鎂2 g、葡萄糖10 g、去離子水1 L;最優(yōu)種子培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為29℃，搖床轉(zhuǎn)速240 r/min、玻璃珠6個、培養(yǎng)基裝量30 mL/250 mL，在該培養(yǎng)條件下，可獲得最大生物量。

刺糖多孢菌 多殺菌素 正交實驗 生長曲線

刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)屬糖多孢菌屬，是一種好氧型革蘭氏陽性的非抗酸性放線菌［1］，其有氧發(fā)酵可產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物多殺菌素。多殺菌素是一種新型高效的生物殺蟲劑，主要用于農(nóng)林蟲害、儲糧蟲害、衛(wèi)生蟲害、牲畜寄生蟲害的防治，其產(chǎn)品目前主要用在棉花、果蔬、茶葉、煙草、中草藥、糧食等作物上［2－7］。因其具有殺蟲譜廣、生物活性高、低毒、低殘留，對哺乳動物、魚類、鳥類和大多數(shù)益蟲具有極高的安全界限等優(yōu)點而獲得美國“總統(tǒng)綠色化學(xué)品挑戰(zhàn)獎”［8］。2005年美國環(huán)保署批準將多殺菌素用作儲糧防護劑。

微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌株本身的性能，同時還要賦以合適的環(huán)境條件，才能使其生產(chǎn)能力充分表達。因此，了解生產(chǎn)菌株對環(huán)境條件的要求，如培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度，氧的需求，攪拌速度等，對發(fā)酵生產(chǎn)控制具有重要的指導(dǎo)意義。從20世紀80年代末開始，國外學(xué)者對多殺菌素的發(fā)酵工藝和分離純化工藝研究較多［9－11］，進入21世紀之后，運用基因工程手段選育和改良菌株成為國外學(xué)者研究多殺菌素的主要方向［12－13］。國內(nèi)對多殺菌素的研究起步較晚，主要研究側(cè)重于篩選產(chǎn)多殺菌素的高產(chǎn)菌株及優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基［14－16］，而對其生長特性的研究很少。本試驗對刺糖多孢菌的生長特性及種子培養(yǎng)條件進行了研究，旨在為多殺菌素的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

刺糖多孢菌C3－10－4為本實驗室篩選和保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:葡萄糖5 g/L，牛肉膏3 g/L，酪蛋白胨0.25 g/L，瓊脂18 g/L。

種子培養(yǎng)基組分見表1。

表1 種子培養(yǎng)基組分/g/L

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖50 g/L，棉籽蛋白25 g/L，氯化鈉3 g/L，硫酸亞鐵0.05 g/L，碳酸鈣1 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L。

培養(yǎng)基消毒前pH均為7.2，115℃濕熱滅菌25 min。

葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、硫酸鎂:國藥集團;牛肉膏、酪蛋白胨、蛋白胨、玉米漿:北京奧博星生物技術(shù)公司;胰蛋白酶大豆肉湯、酶解酪蛋白、酵母提取物:美國BD公司。

1.3 儀器

Delta320型pH計:瑞士Mettler Toledo公司;Eppendorf AG 22331 Hamburg型離心機:德國Eppendorf公司;YS100光學(xué)顯微鏡:日本Nikon公司。

1.4 刺糖多孢菌的培養(yǎng)

將保藏菌種接到新鮮斜面培養(yǎng)基中，29℃培養(yǎng)7 d，用無菌水制備成數(shù)量級為108個/mL的孢子懸液，按1%接種量接入種子培養(yǎng)基，在試驗設(shè)計的溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)，試驗均設(shè)定3次重復(fù)。

1.5 生物量測定方法

采用菌體干重法測定生物量［17］。取10 mL培養(yǎng)液于離心管中，3 500 r/min離心15 min，棄去上清液，將菌體于105℃下干燥至恒重，稱量總質(zhì)量，減去離心管質(zhì)量，即為菌體生物量。

1.6 生長曲線的測定

將試驗菌種接種于新鮮斜面培養(yǎng)基中，29℃培養(yǎng)7 d，用無菌水制備成數(shù)量級為108個/mL的孢子懸液，按1%接種量接入種子培養(yǎng)基，于29℃搖床培養(yǎng)7 d。搖瓶裝液量為30 mL/250 mL，玻璃珠6個，搖床轉(zhuǎn)速為240 r/min，偏心距為26 mm。每12 h取樣，測定樣品的生物量和pH，以上試驗設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 最優(yōu)種子培養(yǎng)基的篩選

圖1 培養(yǎng)基與生物量的關(guān)系曲線

圖1為刺糖多孢菌在10種不同種子培養(yǎng)基中生長72 h后生物量的變化情況。結(jié)果表明，刺糖多孢菌在4號配方種子培養(yǎng)基中的生物量最大。同時，觀察4號配方的菌絲體形態(tài)，其菌絲較長且茁壯，生長旺盛，符合種子要求。因此，選用4號培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察不同培養(yǎng)條件對菌株生長的影響。

2.2 溫度對刺糖多孢菌生長的影響

將接種后的種子培養(yǎng)基分別置于27、29、32和35℃環(huán)境下培養(yǎng)，接種量為1%，培養(yǎng)72 h后測定生物量，并鏡檢觀察菌絲形態(tài)，結(jié)果如圖2和圖3所示。

由圖2可知，隨著培養(yǎng)溫度逐步升高，刺糖多孢菌的生物量在29～35℃范圍內(nèi)變化不明顯，且高于27℃培養(yǎng)溫度下的生物量;從圖3鏡檢的結(jié)果來看，當(dāng)培養(yǎng)溫度提高時，菌絲體斷裂現(xiàn)象越來越嚴重。這可能是因為高溫下，菌株的生物活性物質(zhì)蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生變性，酶活性受到影響，細胞功能下降，甚至死亡［18］。刺糖多孢菌在29℃培養(yǎng)溫度下其菌絲體生長最好，菌絲無斷裂現(xiàn)象。因此選擇29℃作為其最適生長溫度。

根據(jù)試驗結(jié)果，在培養(yǎng)溫度29℃下，考察其他培養(yǎng)條件對菌株生長的影響。

2.3 培養(yǎng)基裝量、搖床轉(zhuǎn)速和添加玻璃珠個數(shù)對刺糖多孢菌生長的影響

刺糖多孢菌是一種好氧放線菌，培養(yǎng)基裝量和搖床轉(zhuǎn)速對氧的供給具有重要影響。玻璃珠的加入可以減少菌絲體的抱團，增加氧利用率［19］。通過正交設(shè)計考察上述3種培養(yǎng)條件對生物量的影響。采用混合正交表L16(42×3)，正交因素水平見表2，試驗結(jié)果及方差分析分別見表3和表4。

表2 正交試驗因素水平表

表3 正交試驗結(jié)果

表4 正交試驗方差分析表

運用SPSS16.0對生物量與多殺菌素相對產(chǎn)量進行相關(guān)性考察，結(jié)果表明，生物量與多殺菌素相對產(chǎn)量之間呈高度正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達0.970(P＜0.001)。

正交試驗結(jié)果表明，在不同培養(yǎng)條件下，相對應(yīng)的生物量在P=0.05時不顯著，幾個影響因素的主次關(guān)系依次為:搖床轉(zhuǎn)速＞玻璃珠個數(shù)＞培養(yǎng)基裝量。從表3看出，搖床轉(zhuǎn)速和玻璃珠個數(shù)對生物量影響相對較大，在培養(yǎng)過程中，提高搖床轉(zhuǎn)速和增加玻璃珠個數(shù)，增強了打碎氣泡的能力，氣液接觸表面積增加，供氧能力提高［17］。氧利用率的增加，有助于菌絲體的生長。同時，增加搖床轉(zhuǎn)速和玻璃珠個數(shù)，菌絲受到的剪切力增強。過強的剪切力易導(dǎo)致菌絲體受到機械損傷，生理狀況發(fā)生異常，從而抑制菌體生長［20，21］。觀察菌絲形態(tài)，隨著玻璃珠個數(shù)的增加，菌絲體未發(fā)現(xiàn)斷裂情況，菌絲粗細相當(dāng)。說明該菌株對剪切力的耐受性較強。發(fā)酵工業(yè)中，為了提高供氧能力，會增加發(fā)酵罐攪拌速度，但同時也增強了菌株受到的剪切力，該菌株對剪切力有較強的耐受性，這一結(jié)果對發(fā)酵調(diào)控具有重要的指導(dǎo)意義。

由正交試驗得最優(yōu)方案為搖床轉(zhuǎn)速240 r/min、玻璃珠6個、搖瓶裝液量30 mL/250 mL。驗證試驗結(jié)果表明，在此培養(yǎng)條件下，菌體生物量達到9.98 g/L，高于正交試驗生物量。

2.4 刺糖多孢菌的生長曲線及其 Gompertz方程擬合

2.4.1 生長曲線的測定

圖4 刺糖多孢菌的生長曲線

刺糖多孢菌C3－10－4的生長曲線見圖4。從圖4中可以看出，菌株在生長36 h后進入對數(shù)生長期，72 h后進入平穩(wěn)期。pH呈現(xiàn)穩(wěn)步增長的趨勢，變化范圍從pH 6.9到8.9，當(dāng)pH＞8.7時，菌絲體出現(xiàn)斷裂，開始自溶。pH是影響菌株體內(nèi)各種酶活性的重要因素，pH的變化會引起酶活力的改變，從而影響菌株在培養(yǎng)過程中的代謝速度，甚至改變其代謝途徑和細胞結(jié)構(gòu)［18］。菌絲繁殖到一定程度后，由于養(yǎng)分的耗盡以及代謝產(chǎn)物的積累，菌體量不再增加，菌絲體逐漸老化，工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，要選擇菌體處在生命力極為旺盛的對數(shù)生長期，且培養(yǎng)液的菌體量未達到高峰的時期作為移種時間。從生長曲線來看，刺糖多孢菌最適種齡在60～70 h為宜。

2.4.2 Gompertz方程擬合曲線

根據(jù)模型分類方法，微生物生長曲線的模型屬于初級模型，它描述了微生物的數(shù)量與時間變化之間的關(guān)系，從曲線上可以得出有關(guān)微生物生長的參數(shù)，如初始菌液濃度、延滯期、生長率、菌液最大濃度等。Gompertz模型是一種描述光滑S型曲線，且有一個固定拐點的方程。為了考察刺糖多孢菌的生長特性，運用Gompertz方程模擬實驗菌株的生長趨勢［22－24］。Gompertz方程如式:

式中:X為生物量的質(zhì)量濃度/g/L;μm為最大的比生長速率，即生長曲線上通過拐點的切線/g/h;λ為延滯期時間，即切線在x軸上的截距/h;A為即漸近線值，就是可能達到的相對最大的菌濃度/g/L;t為菌株培養(yǎng)時間/h;e為常數(shù)2.718 28。

根據(jù)最小二乘法原理，運用統(tǒng)計軟件SPSS16.0對生長曲線進行曲線擬合，擬合后的Gompertz曲線見圖5。

圖5 Gompertz擬合生長曲線圖

Gompertz方程對菌株生長曲線方程進行回歸，其相關(guān)系數(shù)R=0.974，可見該模型回歸效果較好。因此，可以用Gompertz方程來擬和并預(yù)測刺糖多孢菌的生長曲線，擬合后的生長曲線方程為:

X=8.420exp［－exp(2.183－0.057 5t)］

此時，延滯期λ=20.589 h，最大比生長速率μm= 0.187 g/h，相對最大菌質(zhì)量濃度A=8.420 g/L。

3 結(jié)論

種子的質(zhì)量是發(fā)酵能否正常進行的重要因素之一，通過對刺糖多孢菌種子培養(yǎng)基的篩選，以及對培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基裝量、搖床轉(zhuǎn)速和添加玻璃珠個數(shù)的研究，確定其最佳培養(yǎng)溫度29℃、搖床轉(zhuǎn)速240 r/min、玻璃珠個數(shù)6個、搖瓶裝液量30 mL/250 mL。利用Gompertz方程對生長曲線進行擬合，得到擬合曲線方程為:

X=8.420exp［－exp(2.183－0.057 5t)］

本研究為進一步了解刺糖多孢菌菌種特性及提高其代謝產(chǎn)物多殺菌素的產(chǎn)量提供了重要的參考依據(jù)，為多殺菌素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。

［1］Frederick P M，Raymond C Y.Saccharopolyspora spinosa sp.nov.Isolated from Soil Collected in a Sugar Mill Rum Still［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1990，40(1):34－39

［2］Thompson G，Michel K.The discovery of Saccharopolyspora spinosa and a new class of insect products［J］.Down to Earth，1997，52(1):1－5

［3］李榮貴，王普，梅建鳳，等.新型生物殺蟲劑——刺糖菌素［J］.微生物學(xué)通報，2003，30(1):77－81

［4］陳小龍，鄭裕國，沈寅初.農(nóng)用抗生素刺糖菌素(Spinosads)的研究進展［J］.微生物學(xué)報，2002，41(1):4－7

［5］Thompson G D，Robert D，Sparks T C.Spinosad－a case study:an example from a natural products discovery programme［J］.Pest Management Science，2000，8:696－702

［6］吳霞.多殺菌素——以天然產(chǎn)物開發(fā)新農(nóng)藥的范例［J］.世界農(nóng)藥，2004，1:24－28

［7］李姮，汪清民，黃潤秋.多殺菌素的研究進展［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2003，5(2):1－12

［8］徐志紅，蔣志勝.生物殺蟲劑多殺菌素的中毒癥狀和作用機理［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理，2004，25(2):25－28

［9］Baker P J.Process for isolating A83543 and its components: USA，5227295［P］.1993－07－13

［10］Mynderse J S，Mabe J A，Turner J R，et al.A83543 compounds and process for production thereof:USA，5670486［P］.1997－09－13

［11］Boeck L D，Greenfield H C，Michel K H，et al.Process for producing A83543 compounds:USA，5362634［P］.1994－11－08

［12］Madduri K，Waldron C，Matsushima P，et al.Genes for the biosynthesis of spinosyns:applications for yield improvement in Saccharopolyspora spinosa［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2001，27:399－402

［13］Waldron C，Matsushima P，Rosteck P R，et al.Cloning and analysis of the spinosad biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora spinosa［J］.Chemistry and Biology，2001，8:487－499

［14］代鵬，徐雪蓮，賀玉平，等.多殺菌素生產(chǎn)菌株發(fā)酵配方及條件的優(yōu)化［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，25(3):245－248

［15］梁艷，盧文玉，聞建平.Minitab軟件在多殺菌素發(fā)酵條件優(yōu)化中的應(yīng)用［J］.中國抗生素雜志，2008，33(11):659－622

［16］Jin Z H，Wu J P，Zhang Y，et al.Improvement of spinosad producing Saccharopolyspora spinosa by rational screening［J］.Journal of Zhejiang University，2006，7:366－370

［17］李福.刺糖菌素產(chǎn)生菌的菌種選育及發(fā)酵條件優(yōu)化研究［D］.浙江:浙江工業(yè)大學(xué)，2004

［18］鄔行彥，熊宗貴，胡章助.抗生素生產(chǎn)工藝學(xué)［M］..北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1985:123～125

［19］顧覺奮.抗生素［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2001: 84－87

［20］Giannuzzi L，Pinotti A，Zaritzky N.Mathematical modeling of microbial growth in packaged refrigerated beef stored at different temperatures［J］.International Journal of Food Microbiology，1999，16:269－279

［21］周建，王軍峰.剪切力對必特螺旋霉素發(fā)酵的影響［J］.食品與藥品，2008，10(1):18－21

［22］李秋蕊.富鍺羊肚菌菌絲體深層發(fā)酵的研究［D］.吉林:吉林大學(xué)，2005

［23］徐天宇.食品微生物生長預(yù)測模型［J］.食品科學(xué)，1995，16(1):17－23

［24］周康，劉壽春.食品微生物生長預(yù)測模型研究新進展［J］.微生物學(xué)通報，2008，35(4):589－594.

Growth Characteristics and Culture Conditions of Saccharopolyspora spinosa

Li Li1，2Luo Lisi2，3Wang Yanping1Li Nengwei Guo Weiqun2Wang Jieying1，2Zhang Xiaolin2
(College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology1，Tianjin 300457)
(Academy of State Administration of Grain2，Beijing 100037)
(College of Life Sciences，Guizhou University3，Guizhou 550025)

Gowth of Saccharopolyspora spinosa was studied and its culture conditions were optimized.Single factor experiments and orthogonal test were chosen to determine the optimal seed medium，culture temperature and fermentation medium.Additionally，its growth curve was predicted by Gompertz equation.Results:The optimal seed medium is tryptic soy broth 30 g，yeast extract 3 g，MgSO42 g，glucose 10 g and deionized water 1 L.The optimal seed culture conditions are culture temperature 29℃，volume of medium 30 mL/250mL flask，rotation speed 240 r/min and 6 glass beads.Under the optimal culture conditions，the biomass reaches the maximum.

Saccharopolyspora spinosa，spinosad，orthogonal design，growth curve

Q939.97 文獻標識碼:A 文章編號:1003－0174(2010)11－0089－05

國家科技支撐計劃(2006BAD08B02)

2009－10－26

李麗，女，1984年出生，碩士，食品科學(xué)與工程

張曉琳，女，1975年出生，副研究員，博士，微生物發(fā)酵和基因工程研究