海藻酸鈉、卡拉膠聯合固定化木瓜蛋白酶特性研究

唐遠謀，焦士蓉，朱清華，唐鵬程，閔 甜

（西華大學生物工程學院，四川成都610039）

海藻酸鈉、卡拉膠聯合固定化木瓜蛋白酶特性研究

唐遠謀，焦士蓉*，朱清華，唐鵬程，閔 甜

（西華大學生物工程學院，四川成都610039）

以海藻酸鈉、卡拉膠共混包埋制備固定化木瓜蛋白酶，并對木瓜蛋白酶固定化條件和固定化酶的部分性能進行了探討。在海藻酸鈉濃度1.5%、卡拉膠濃度0.8%、木瓜蛋白酶濃度1.0%、氯化鈣濃度4.0%、固定化時間11h、固定化溫度為35℃、固定化pH7.5的條件下，可以獲得最佳的固定化效果，固定化酶活力回收率為56.27%。與游離酶相比，制備固定化酶的最適酶促反應pH由7.0降至6.5，最適酶促反應溫度由40℃升至50℃，其作用溫度范圍、pH范圍均比游離酶范圍寬。

木瓜蛋白酶，固定化酶，海藻酸鈉，卡拉膠

木瓜蛋白酶 北京奧博星生物技術責任有限公司；海藻酸鈉、L－酪氨酸、干酪素 成都科龍化工試劑廠；卡拉膠 天津市博迪化工有限公司；其余試劑均為分析純。

SHZ－D（Ⅲ）循環水式真空泵，DHG－9070A電熱恒溫鼓風干燥箱，HH－S4數顯恒溫水浴鍋，電子天平，UV－2600型紫外可見分光光度計，家用冷凍冷藏箱，WTL超微臺式離心機，酸度計（PHS－3C）。

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化木瓜蛋白酶的制備 參照文獻［5］的方法固定木瓜蛋白酶。在測定固定化木瓜蛋白酶活力之前將經過一段時間硬化的固定化酶顆粒進行抽濾，并在恒溫干燥箱中40℃下干燥1h后取出稱其總重m0。

1.2.2 酶活力的測定方法［6］取試管1：加入游離木瓜蛋白酶液1mL，pH7.5的磷酸鹽緩沖液3mL，40℃水保溫10min，精確加入40℃預熱的2%酪蛋白溶液5.0mL，混合均勻，立刻置于40℃水浴中，每隔5min振搖一次，反應45min后，加入5.0mL的10%三氯乙酸，迅速搖勻終止反應。

取試管2：同試管1的做法，改變酪蛋白和三氯乙酸的加入順序。

將上述試管溶液于3500r/min離心10min，分別取上清液。以試管2離心上清液作為試管1的參比，在波長275nm處測定試管1的吸光度A。

酪氨酸對照液的測定：以0.2mol/L鹽酸溶液作參比，在波長275nm處測定酪氨酸對照液的光吸收值As。

酶活力的計算公式如下：

式中：A－試管1測定的光吸收值；As－酪氨酸對照液的光吸收值；C對照－酪氨酸的濃度（!g/mL）；M對照－酪氨酸的分子量（181.19）；V總－反應總體積（mL）；V樣品－加入的樣液的體積（mL）；m樣品－加入的樣品的質量（g）；t－反應時間（min）；n－樣品的稀釋倍數。

酶活力的回收：

1.2.3 單因素實驗 選取海藻酸鈉濃度、卡拉膠濃度、木瓜蛋白酶濃度、氯化鈣濃度、固定化時間、固定化溫度、固定化pH進行單因素實驗，逐一實驗時固定其他6個條件，各選取不同的因子不同水平進行固定化研究。

1.2.4 正交實驗 根據單因素實驗結果，以海藻酸鈉濃度、固定化溫度、酶固定化pH、氯化鈣濃度，這4個因素設計正交實驗。

1.2.5 木瓜蛋白酶游離酶和固定化酶的特性（最適酶促反應pH和溫度）研究 在pH7.0的緩沖液中配制酶溶液，酶濃度為1.0%，所取反應液為1.0mL，固定其他條件，在pH6.0～8.0、溫度20～60℃之間的磷酸緩沖液中分別測定固定化酶和游離酶的相對活性。

2 結果與分析

2.1 木瓜蛋白酶最適固定化條件的單因素實驗

2.1.1 海藻酸鈉濃度的確定 海藻酸鈉濃度不僅影響酶的固定率，還影響到膠珠的成型和反應性能。濃度太低不能成珠；濃度過高擠珠困難，還會使得壁材過厚，降低靈敏度［7］。由表1可知，當海藻酸鈉濃度為1.5%時，酶活力回收率最大。

表1 海藻酸鈉濃度對酶固定化的影響

2.1.2 卡拉膠濃度的確定 當卡拉膠濃度較低時，固定化顆粒較小，較軟，當增大到一定濃度時，固定化酶活力變化不大。由表2確定卡拉膠最適濃度為0.8%。

表2 卡拉膠濃度對酶固定化的影響

2.1.3 木瓜蛋白酶濃度的確定 從表3看出，當酶濃度為1.0%時，制備的固定化酶活力達到最大值。

表3 木瓜蛋白酶濃度對酶固定化影響

2.1.4 氯化鈣濃度的確定 氯化鈣與海藻酸鈉反應形成海藻酸鈣凝膠是包埋法固定化酶的一個重要過程，同時氯化鈣對形成凝膠的機械強度也有重要影響。由表4可知，最適氯化鈣濃度為4.0%。

表4 氯化鈣濃度對酶固定化的影響

2.1.5 固定化時間的確定 隨著固定化時間的增加，固定化酶相對活力呈上升趨勢，當上升到一定程度便趨于穩定。由表5可知，固定化時間為11h。

表5 固定化時間對酶固定化的影響

2.1.6 固定化溫度的確定 溫度增加時，酶在固定化過程中活力損失增加，由表6可知，最適固定化溫度為45℃。

表6 固定化溫度對酶固定化的影響

2.1.7 固定化pH的確定 實驗結果見表7，得到最適固定化pH為7.0。

表7 固定化pH對酶固定化的影響

2.2 木瓜蛋白酶固定化的正交實驗

正交實驗結果見表8。

表8 L9（34）正交實驗結果表

由極差R可知，各因素對固定化酶活力回收率次序為：D＞C＞B＞A，溫度為主要因素，固定化最佳方案是A2B2C3D1，即海藻酸鈉濃度為1.5%，固定化溫度為35℃，固定化pH為7.5，氯化鈣溶液濃度為4.0%。以此條件進行實驗，固定化酶活力回收率為56.27%。

2.3 木瓜蛋白酶游離酶和固定化酶的特性

2.3.1 最適酶促反應pH 結果見圖1。由圖1可得，固定化酶最適pH為6.5，游離酶的最適pH7.0，固定化酶比游離酶較耐酸，顯示出比游離酶更寬泛的pH適應性，其原因可能是固定化載體維持了酶空間結構的穩定性。

圖1 最適酶促反應pH

2.3.2 最適酶促反應溫度 結果見圖2。由圖2可以看出，固定化酶的最適溫度為50℃，比游離酶的最適溫度40℃高出10℃，且對于高溫有更好的穩定性。這表明固定化提高了木瓜蛋白酶的熱穩定性，分析原因可能是固定化載體提高了酶的空間結構對熱的穩定性。

圖2 最適酶促反應溫度

3 結論

3.1 由單因素實驗及正交實驗，得到最優水平組合，即海藻酸鈉濃度1.5%、卡拉膠濃度0.8%、木瓜蛋白酶濃度1.0%、氯化鈣濃度4.0%、固定化時間為11h、固定化溫度為35℃、固定化pH為7.5，以此條件固定化木瓜蛋白酶，其酶活力回收率達56.27%。

3.2 探究固定化酶的特性與游離酶相比，得知固定化酶比游離酶較耐酸，顯示出比游離酶更寬泛的pH適應性，且對于高溫有更好的穩定性。

［1］乙引，張顯強，唐金剛，等.木瓜蛋白酶的純化和性質［J］.貴州師范大學學報，2002，20（1）：11－14.

［2］Nitsawang S，Raini H K，Kanasawud P.Purification of pa－pare from carlca papaya latex：Aqueous two－phase extraction versus two－step salt precipitation［J］.Enzyme Microb Techn，2006，39（5）：1103－1106.

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［6］金鋒.微孔淀粉－海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶的研究［J］.中國釀造，2009（7）：83－85.

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Study on immobilized papain property with alginate and gum kala mixture

TANG Yuan－mou，JIAO Shi－rong*，ZHU Qing－hua，TANG Peng－cheng，MIN Tian
（School of Bioengineering of Xihua University，Chengdu 610039，China）

Papain was immobilized by encapsulated in hydrogel beads prepared with alginate and gum kala，the immobilization conditions and partial properties of immobilized enzyme were investigated.The recovery of immobilized enzyme activity after 11h of immobilization at 35℃ and pH 7.5 was 56.27%，under the optimum operation conditions that the concentration of sodium alginate，gum kala，papain and CaCl2solution were 1.5%，0.8%，1.0%and 4.0%respectively.Compared with the free enzyme，the optimum pH value of immobilized papain decreased form 7.0 to 6.5，while the temperature increased from 40℃ to 50℃，which showed a wider range of reaction pH value and temperature than the free enzyme.The thermostability of immobilized papain was better than the free enzymes.

papain；immobilized enzyme；alginate；gum kala

TS201.2+5

A

1002－0306（2010）12－0209－03

木瓜蛋白酶（Papain，EC3.4.22.2）是從番木瓜中提取出的一種蛋白水解酶，具有強的蛋白水解活力，又含凝乳和溶菌活力，還具有脂解及蛋白合成功能，在輕紡、食品、醫藥等工業領域中廣泛應用［1－2］。游離的木瓜蛋白酶穩定性較差，并且使用后分離純化較困難，大大降低了其使用效率。固定化酶具有很好的穩定性且易與底物、產物分離，從而提高了使用效率，正逐步受到人們的重視。海藻酸鈉、卡拉膠作為天然高分子材料因其安全、環保以及優良的工藝性能，是食品酶工程中常用的包埋材料［3－4］。本文采用海藻酸鈉、卡拉膠聯合固定化木瓜蛋白酶，得到了最佳的固定條件并對固定化酶特性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2010－01－04 *通訊聯系人

唐遠謀（1986－），男，碩士研究生，研究方向：食品營養與安全。