陰離子交換樹脂固定化果糖基轉移酶的研究

馬玉紅,翁桂華,張 濤,江 波

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

陰離子交換樹脂固定化果糖基轉移酶的研究

馬玉紅,翁桂華,張 濤,江 波＊

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

從 13種離子交換樹脂和吸附樹脂中,篩選出固定化效果較好的大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂D380為載體,以戊二醛為交聯劑,通過先吸附后交聯的方法對果糖基轉移酶的固定化進行分析,并對固定化條件進行了優化。結果表明,最佳固定化條件為：加酶量為 200U/g樹脂,吸附 pH為 6.0,吸附時間為 6h,吸附溫度為 30℃,交聯劑戊二醛濃度為 0.01%,交聯時間為 6h,交聯溫度為 4℃,固定化酶活回收率最高可達 87.6%以上。

果糖轉移酶,固定化,樹脂

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉AS0023 為江南大學食品科學與技術國家重點實驗室保藏菌種;樹脂 D202-Ⅱ309 213 313蘇青集團;X-5 DA201-B H-103 D301-Ⅲ 南開大學化工廠;D151 D152 D380 天津波鴻建材;5%戊二醛水溶液 中國醫藥 (集團)上海化學試劑公司。

Centrifuge 5084R冷凍離心機,SCIENTZ-2D超聲波細胞破碎儀,Waters 209高效液相色譜儀,SHA-2冷凍恒溫水浴振蕩器。

1.2 實驗方法

1.2.1 樹脂的預處理 吸附樹脂采用乙醇、丙酮、蒸餾水交替處理,最后用蒸餾水沖洗至中性備用;離子交換樹脂先用蒸餾水浸泡脹潤、去雜,然后用 4% HCl、4%NaOH交替處理,最后用蒸餾水沖洗至中性,置于 4℃冰箱保存備用。

1.2.2 游離果糖轉移酶提取方法 黑曲霉 AS0023細胞的制備見參考文獻[12]。稱取一定量黑曲霉細胞放入燒杯中,加入適量的 0.05mol/L、pH5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液,在冰浴環境中用超聲波細胞破碎儀處理一定時間后,于 4℃下冷凍離心 (10000×g) 20min,收集上清液在 4℃條件下進行超濾以提高單位酶活,壓力 0.15MPa,截留相對分子質量 10000,粗酶提取液放入冰箱保藏備用。

1.2.3 果糖轉移酶的固定化方法 用濾紙吸干濕樹脂表面的水后稱取 0.5g于三角瓶中,加入一定量的酶液,在所需的 pH下在恒溫水浴振蕩器中緩慢振蕩吸附一定時間后,加入一定量的戊二醛進行交聯。交聯完成后,棄去上清,用緩沖溶液沖洗戊二醛殘留及未固定上的游離酶,所得固定化酶用緩沖液浸泡待用。

1.2.4 酶活測定方法 游離果糖基轉移酶活測定：一定體積底物濃度為10%(w/v)0.05mol/L、pH5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液于直徑 50mm、100mL的恒溫夾套酶反應器中,50℃下恒溫攪拌反應 1h,于沸水中煮沸 10min終止反應。

1.2.5 糖組分測定方法 采用 HPLC(高效液相色譜)法[12]。HPLC,Waters 209系列,配有 R401示差折光檢測器和 M740數據處理器;色譜柱：Hewlett Packard公司 APS Hypersil 4.6×100mm填料密度5μm;流動相：乙睛/水 75/25,流速 1mL/min;溫度28℃;進樣量：10μL。

1.2.6 酶活力定義 每分鐘產生 1μmol蔗果三糖(1-kestose)為一個酶活力單位。酶用量為 2U/g蔗糖。固定化酶活測定方法同游離果糖基轉移酶活的測定方法。固定化酶活回收率：酶活回收率定義為固定化酶活與所添加的總酶活的比值。

2 結果與分析

2.1 樹脂載體的選擇

不同樹脂對果糖基轉移酶的固定化效果如表 1所示。

由表 1可知,不同樹脂的固定化效果差別明顯,其中D380和D296R固定化酶活力和酶活回收率均表現突出。另外,表中還有幾種陽離子交換樹脂未列出,實驗發現陽離子樹脂基本不能固定化果糖基轉移酶,這可能是因為使用陽離子交換樹脂時,為使酶蛋白帶正電荷,就要使固定化 pH低于該酶等電點,而過低的 pH不利于酶活性的發揮從而使酶失活。D380為大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂,其功能基團為伯氨基,因其具有弱堿性陰離子交換樹脂較高的離子交換容量和容易再生等特點,已較成功地固定了木聚糖酶、α-淀粉酶等,故選擇 D380樹脂作為本實驗的固定化載體。

2.2 固定化條件的優化

2.2.1 加酶量對固定化效果的影響 固定其它條件,選擇不同的加酶量進行實驗,結果如圖 1所示。

圖1 加酶量對固定化效果的影響

由圖 1可以看出,隨著加酶量的增大,固定化酶活逐漸增大,但酶活回收率逐漸降低,而當加酶量大于 400U/g載體時,固定化酶活的增加也變緩慢,這是因為在離子交換樹脂的活性基團未被酶交聯飽和前,固定化酶活將隨著加酶量的增加而增加;在活性基團被酶交聯飽和后,固定化酶的活力不在隨加酶量的增加而明顯增加,甚至當加酶量達到一定程度時,會因為結合的酶分子過多而造成酶作用的空間位阻加大,使酶活性增加緩慢,甚至出現下降。因此,綜合考慮固定化酶活和酶活回收率,最適加酶量選擇 200U/g。

2.2.2 吸附 pH對固定化效果的影響 固定其它條件,改變酶液 pH進行實驗,結果如圖 2所示。

圖2 吸附pH對固定化效果的影響

由圖 2可以看出,在pH3～6時,隨著pH的增大,固定化酶活和酶活回收率都明顯增大,當 pH大于 6以后,固定化酶活和酶活回收率都開始下降,這可能是與本實驗所用果糖基轉移酶的 pH穩定性有關,過高、過低的極端 pH會對酶的穩定性產生不利影響,致使固定化酶活降低,因此,最適的吸附 pH為 6.0。

2.2.3 吸附時間對固定化效果的影響 固定其它條件,選擇不同吸附時間進行實驗,結果如圖 3所示。

由圖 3可以看出,隨著吸附時間的延長,固定化酶活和酶活回收率均增大,但是在 6h后增加緩慢,這是因為隨著時間的延長,陰離子樹脂表面的可交換基團與酶蛋白的交換已逐漸達到平衡,而在平衡后再繼續增加吸附時間,樹脂上的可交換基團基本沒有了,所以變換緩慢,從經濟角度考慮,選擇 6h,既可以達到較好的固定化效果又可以縮短固定化時間。

表1 不同樹脂的固定化效果比較

圖3 吸附時間對固定化效果的影響

2.2.4 吸附溫度對固定化效果的影響 固定其它條件,選擇不同吸附溫度進行實驗,結果如圖 4所示。

圖4 吸附溫度對固定化效果的影響

由圖 4可以看出,在較低溫度范圍內,隨著溫度的升高,固定化酶活和回收率都逐漸增加,當溫度超過 30℃后,固定化酶活迅速下降,這可能是因為溫度過高會使戊二醛對酶的變性作用增大,同時溫度過高也不利于酶的穩定性,溫度較高時,酶容易失活;另一方面,蛋白質的吸附是吸熱過程,在溫度較低時,酶也不容易吸附到樹脂上。因此固定化溫度以30℃左右為宜。

2.2.5 戊二醛量對固定化效果的影響 固定其它條件,選擇不同戊二醛量進行實驗,結果如圖 5所示。

圖5 戊二醛量對固定化效果的影響

由圖 5可以看出,在較低戊二醛濃度時,固定酶活逐漸增大,當戊二醛濃度繼續增大時,固定化酶活和酶活回收率都隨戊二醛濃度的增加而降低。在交聯過程中,戊二醛既是固定化反應的交聯劑,同時又是酶反應的變性劑,當戊二醛加入量不夠時,交聯反應進行不徹底,酶固定化不牢固;而交聯劑加入過多時,過度的分子內交聯反應會影響酶活性中心與底物的結合,從而降低了酶活,所以戊二醛濃度以0.01%(v/v)為宜。

2.2.6 交聯時間對固定化效果的影響 固定其它條件,選擇不同交聯時間進行實驗,結果如圖 6所示。

圖6 交聯時間對固定化效果的影響

由圖 6可以看出,隨著交聯反應時間的延長,酶活力逐漸增加,在此階段主要發生的是酶分子間交聯反應,但超過 6h以后,酶活力增加緩慢,這是因為分子間交聯反應達飽和后,開始發生酶分子內交聯,增加了酶分子間的空間位阻,直接影響到酶活性中心對底物的定位作用,且內擴散阻力也增大,而且戊二醛可發生交聯反應的醛基數目有限,再增加交聯時間對固定化效果的提高也很有限,所以交聯時間以6h為宜。

2.2.7 交聯溫度對固定化效果的影響 固定其它條件,選擇不同交聯溫度進行實驗,結果如圖 7所示。

圖7 交聯溫度對固定化效果的影響

由圖 7可以看出,在 0～4℃時固定化酶活和回收率逐漸增大,隨著溫度的逐漸升高固定化酶活反而降低,這可能主要是由于戊二醛的交聯性質與其所在的 pH環境有關,溫度偏高或者偏低都會改變戊二醛的 pH環境,從而使其降低甚至喪失交聯反應的功能,因此交聯溫度以 4℃為宜。

3 結論

篩選出大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂D380為載體,通過先吸附后交聯的方法對果糖基轉移酶進行固定化,優化的固定化條件為：加酶量為200U/g樹脂,在 30℃、pH6.0的條件下吸附反應 6h,加 0.01%(v/v)的交聯劑戊二醛在 4℃交聯 6h,獲得的固定化酶酶活回收率可達 87.6%。

[1]Yun J W.Fructooligosaccharides-Occurrence,preparation and application[J].Enzyme and Microbial Technol,1996,19：107-117.

[2]P T Sangeetha.Recent trends in the microbial production analysis and application of fructooligosaccharides[J].Food Science And Technology,2005,16：442-457

[3]ShiomiN,Izaw a M.Purification and characterization of sucrose：sucrose 1-F fructosylt ransferase from the roots of asparagus[J].Agric Biol Chem,1980,44：6032614.

[4]Hidaka H,Hirayama M,Sum iN.A fructoolilgosaccharide producing enzyme fromAsperg illus nigerA TCC 20611[J].Agric BiolChem,1988,52：1 18121 187.

[5]魏遠安,謝慶武,姚評佳,等 .固定化果糖基轉移酶的理化性質及穩定性研究[J].廣西大學學報：自然科學版,2002,27 (1)：1-4.

[6]張偉,楊小紅,楊秀山 .果糖基轉移酶及其固定化研究進展[J].生命科學,2001(13)：45-46.

[7]Hayashi S,Hayashi T,Kinoshita J,et al. Immobilization of fructofuranosidase fromAureobasidiumsp.ATCC 20524 on porous silica[J].J IndMicrobio,1992,15(9)：2472250.

[8]Chiang C,Lee C,Sheu D,et al. Immobilization ofβfroctofuranosidase fromAspergilliuson methacrylamide-based polymeric beads for production of fructooligoaccharides[J]. Biotechnol Prog,1997,13(4)：5772582.

[9] Yun J,Jung K,OH J.Continuousproduction of fructooligosaccharides from sucrose by immobilized fructosyltransferase[J].Biotech Techniques,1995,9(11)：805-808.

[10]魏遠安,馬麗,楊海,等 .固定化酶法合成蔗果低聚糖的研究[J].食品與發酵工業,1995,21(4)：12216.

[11]張艷,江波,陳超 .離子交換樹脂固定果糖轉移酶[J].無錫輕工大學學報,2004,23(4)：60264.

[12]江波 .固定化黑曲霉生產低聚果糖的研究[D].無錫：無錫輕工業學院,1992.

Study on the immobilization of fructosyltransferase by anion-exchange resin

MA Yu-hong,W ENG Gui-hua,ZHANG Tao,JIANG Bo＊
(State KeyLaboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Fruc tosyltransfe rase was imm ob ilized on13kinds of ion-exchange and adsorp tion res ins,am ong them D380showed the exce llent result for imm ob iliza tion.Then the enzym e was imm ob ilized through c ross-linkage of g luta ra ldehyde.The op t im um cond itions for the imm ob iliza tion we re as follows：200U of enzym e p e r g we t res in,pH 6.0,30℃,and6h,resp ec tive ly.The c ross linking temp e ra ture and t im e we re4℃ and6h resp ec tive ly,and the concentra tion of the c ross linking agent(g luta ra ldehyde)was0.01%.The ac tivity yie ld of imm ob ilized enzym e was above87.6%.

fruc tosyltransfe rase; imm ob iliza tion;res in

TS201.1

A

1002-0306(2010)02-0174-04

低聚果糖 (Fructooligosaccharides,簡稱 FOS),又稱寡果糖或蔗果三糖族低聚糖,分子式為：G-F-Fn, n=1～3(G為葡萄糖,F為果糖)。它是由蔗糖和 1～3個果糖基通過β-2-1糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。它是利用微生物或植物中具有果糖基轉移活性的酶作用于蔗糖而得的,反應過程可以用以下反應式表示[1]：

由于 FOS具有優異的生理學功能而普遍地被用作保健食品配料[2],其在自然界廣泛存在于牛蒡、洋蔥、大蒜、香蕉等許多天然植物中[3],但含量很低。商品化的 FOS首先被 Hidaka H[4]用酶法開發成功,他從研究黑曲霉的果糖基轉移酶開始,然后成功地應用于 FOS的工業化生產[5]。目前國內工業化生產FOS的技術多為液體深層發酵法,但該法的缺點是產酶菌絲體只能利用一次,在 FOS生產過程中,由于菌絲體及其培養基成分的存在并參與反應,使整個工藝繁雜,成本高[6]。而酶的固定化技術為提高酶的使用效率、降低生產成本提供了可能性。因此,近年來果糖基轉移酶的固定化也逐漸成為研究的熱點,已報道的有以多孔硅石、DEAE-纖維素、多孔離子交換劑、殼聚糖凝膠、大孔陰離子交換樹脂 201等為載體的固定化方法[7-11]。實驗以大孔苯乙烯系陰離子交換樹脂D380為載體,采用先吸附后交聯的方法對黑曲霉果糖基轉移酶進行固定化,并對其固定化條件進行了探討,為固定化酶在低聚果糖的生產提供了理論依據。

2009-03-30 ＊通訊聯系人

馬玉紅(1982-),女,碩士研究生,研究方向：食品生物技術。

重點實驗室目標導向項目(SKLF-MB-200804)。