纖維素酶提取蘋果渣黃酮及抗氧化研究

王巖巖,劉 濤,張崇堯,尹琳琳,吳光旭

(長江大學生命科學院,湖北荊州 434100)

纖維素酶提取蘋果渣黃酮及抗氧化研究

王巖巖,劉 濤,張崇堯,尹琳琳,吳光旭＊

(長江大學生命科學院,湖北荊州 434100)

研究了纖維素酶提取蘋果渣黃酮的工藝條件及抗氧化活性。結果表明,與傳統化學法相比,纖維素酶法提取蘋果渣黃酮較好,黃酮提取率從 0.43%提高到 0.56%。對酶法提取工藝進行優化,得到最佳工藝條件為：纖維素酶濃度 0.2%,pH=5.2,酶解溫度 60℃,酶解時間 40min。在最佳條件下,纖維素酶法所得黃酮的提取率可達到 1.26%,為化學法黃酮提取率的 2.93倍。并對提取的黃酮進行羥自由基清除實驗,發現酶法與化學法提取黃酮的成分清除能力相似,表明兩種方法提取黃酮物質結構可能一樣。

纖維素酶,黃酮,蘋果渣

蘋果 荊州市水果市場,榨汁后,60℃通風干燥3d,粉碎過40目篩備用;纖維素酶 酶活性≥10U/mg,上海國藥集團化學試劑公司;蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所,分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘋果渣黃酮的提取

1.2.1.1 醇提法[3]將烘干過的蘋果渣粉碎,過 40目篩,稱取 3.00g,加入 90%乙醇水溶液 100mL浸提3h,收集浸提液,濾渣重復浸提一次,合并兩次的浸提液,過濾,蒸餾濃縮,用蒸發皿揮干得粗黃酮類物質呈棕紅色膏狀(W1)。

1.2.1.2 纖維素酶法[4]稱取蘋果渣粉 3.00g,放入250mL燒杯中,加入0.050g纖維素酶,加入 50mL(pH =4.8)的 HAc-NaAc緩沖液,50℃水浴 1.5h。90℃水浴 30min使酶滅活。加入無水乙醇使其濃度為90%,浸提 3h,回收浸提液,濾渣再加入 90%乙醇溶液 100mL重復浸提一次,合并兩次的浸提液,過濾,蒸餾濃縮,用蒸發皿揮干得粗黃酮類物質呈棕紅色膏狀

1.2.2 黃酮含量的測定

1.2.2.1 標準曲線的繪制[1]準確稱取 0.0250蘆丁,用 30%乙醇溶解,完全移入 250mL容量瓶中,定容。取此蘆丁標準液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL放入 6支25mL容量瓶中,用 30%乙醇補至 5mL,加入 0.3mL 5%NaNO2溶液搖勻放置 6min;加入 0.3mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻,放置 6min;加入 4mL,1mol/L NaOH溶液,搖勻,放置 10min,于波長 510nm處測定吸光度。得回歸方程：y=1.0713x+0.0037,R2= 0.9998。其中：x表示蘆丁濃度 (10-4g/L),y表示對應吸光值(OD)。

1.2.2.2 提取物中黃酮含量的測定 準確稱取適量的蘋果渣粗黃酮 (W2),用 30%乙醇溶解,定容至100mL;取 5mL放入 3支 25mL容量瓶中,用 30%乙醇補至10mL,加入0.3mL的5%NaNO2溶液搖勻,放置 5min,加 0.7mL 10%的 Al(NO3)3溶液搖勻,放置6min;再加入 4mL 1mol/L NaOH溶液,搖勻,定容,放置 10min后,在波長 510nm測定,將測定的吸光值A帶入蘆丁標準曲線中,計算得總黃酮量和黃酮提取率。計算公式如下：

總黃酮量 (g)=W1×(A-0.0037)×0.0001× 100/W2×1.0713

總黃酮提取率(%)=(總黃酮量/W1)×100%

粗黃酮物質提取率(%)=(粗黃酮重量/樣品重量)×100%

其中：W1為不同方法提取得到的蘋果渣粗黃酮重量(g);W2為稱取的適量蘋果渣粗黃酮重量 (g); A表示測定的吸光度。

1.2.3 正交設計 根據單因素實驗,選取對提取工藝有影響的主要因素：酶濃度 (E)、酶解溫度 (T)、pH、酶解時間 (t),按照四因素三水平進行 L9(34)實驗,各因素水平見表 1。

表1 實驗因素水平表

1.2.4 清除羥基自由基活性[5]取 10mL具塞試管,按順序加入 5mmol/L鄰二氮菲 1.5mL、0.5mol/L磷酸緩沖液 pH7.4 3mL、7.5mmol/L FeSO41mL、粗黃酮樣液 3mL、0.1%H2O21mL,用二次蒸餾水稀釋到 10mL,然后于 37℃恒溫水浴鍋保溫 60min,測 A510。未損傷管即：不加 H2O2及抗氧化藥物,標記為 A510(未損傷)。損傷管即：只加 H2O2不加抗氧化藥物,標記為A510(損傷)。按下式計算表觀羥自由基清除率 (E)：

E=[A510(加藥)-A510(損傷)]/[A510(未損傷)-A510(損傷)]×100%

2 結果與分析

2.1 纖維素酶法提取蘋果渣黃酮工藝條件研究

在纖維素酶法提取蘋果渣黃酮的過程中,研究了 pH、酶濃度(E)、酶解時間(t)、酶解溫度對黃酮提取的影響。

2.1.1 pH的影響 在酶解溫度為 50℃,酶解時間為1.5h,酶濃度為 0.1%的條件下,研究了具有不同 pH的 HAc-NaAc緩沖液對提取黃酮的影響。

從表 2中可以看出,隨著 pH的升高,提取得到的蘋果渣中粗黃酮量先升高,后下降。在 pH為 4.8時,粗黃酮達到最高為 2.13g。提取率也隨著 pH的升高而提高,但是在 pH為 5.6時達到最大為 0.81%,故最佳 pH可以選擇 5.6。

表2 pH對黃酮提取的影響

2.1.2 酶濃度的影響 在選定酶解溫度 50℃,HAc-NaAc緩沖液 pH=5.6,酶解時間為 1.5h的條件下,研究酶濃度對黃酮提取的影響。由表 3可得出,在纖維素酶的用量為 0.2%時,黃酮的提取率最高,為0.81%。因此,提取黃酮的纖維素酶的用量選用0.2%。

表3 酶濃度對黃酮提取的影響

2.1.3 酶解時間的影響 酶解時間對蘋果渣黃酮的提取也有一定影響。在 T=50℃、pH=5.6、E=0.2%時,從表 4中可以看出,當酶解 1h,黃酮的提取率最高可達到 1.10%。因此宜選用酶解時間為 1h。

表4 酶解時間對黃酮提取的影響

2.1.4 酶解溫度的影響 在 pH=5.6、t=1.0h、E= 0.2%條件下,酶解過程中分別采用不同的溫度進行水浴,研究溫度對纖維素酶提取蘋果渣黃酮的影響。結果如表 5所示,在 40℃粗黃酮提取量最高,為 2.349g;而 50℃下提取的粗黃酮最低,為 2.193g。但是由于 40℃下蘋果渣中總黃酮的提取量較少,僅能達到 0.0205g,提取率為 0.87%;而 55℃下黃酮的提取率可達到 1.21%,因此最佳溫度選用55℃為宜。

表5 酶解溫度對黃酮提取的影響

2.1.5 正交實驗 通過單因素實驗可以發現,酶用量、酶解時間、酶解 pH及酶解溫度對纖維素酶提取蘋果渣黃酮得率影響較大。且初步優化工藝條件為：E=0.2%、T=55℃、pH=5.6,t=60m in。在此基礎上設計四因素三水平的正交實驗,結果如表6。

表 8 化學法和酶法提取黃酮清除羥自由基活性的比較

表6 正交實驗結果

分析黃酮提取率正交實驗表結果,可以發現 A因素的 K2最大,B因素的 K3最大,C因素的 K3最大,D因素的 K1最大。因此,優化工藝條件為A2B3C3D1,即纖維素酶用量 0.20%,pH=5.2,酶解溫度 60℃,酶解時間 80min。而總黃酮得率正交實驗表結果表明,A因素的 K2最大,B因素的 K3最大,C因素的 K1最大,D因素的 K1最大。故最佳工藝為A2B3C1D1。由極差分析結果可以看出,影響黃酮提取率的因素主次順序為A(酶濃度)→D(pH)→B(酶解溫度)→C(酶解時間)。而影響總黃酮得率的實驗結果的因素主次順序為 A(酶濃度)→B(酶解溫度)→D(pH)→C(酶解時間)。

由于纖維素酶的價格比較昂貴,從工業生產及經濟因素考慮,綜合上述分析得到優化工藝條件為A2B3C1D1,即纖維素酶用量 0.2%,pH=5.2,酶解溫度60℃,酶解時間 40min。

2.2 酶法與化學法提取蘋果渣黃酮

2.2.1 不同方法提取總黃酮含量 在酶解工藝優化條件(纖維素酶用量 0.2%、pH=5.2、酶解溫度 60℃、酶解時間 40min)下,纖維素酶酶解后提取得到的蘋果渣黃酮提取率為 1.26%,與乙醇提取法相比,增加了 2倍左右。提取得到的蘋果渣總黃酮量也有明顯的提高,由 0.0124g上升到 0.0291g,為乙醇提取得到的總黃酮量的兩倍左右,見表 7。

2.2.2 不同方法提取黃酮清除羥自由基活性 從表 8中可以看出,兩種方式所提取的黃酮,清除羥自由基活性極為相似,幾乎沒有差別,初步可以說明采用化學法或酶法所提取的黃酮的結構和成分基本一致。同時從表 8中也可以看出,蘋果渣黃酮的清除羥自由基能力隨黃酮含量的增加而逐漸增強,在濃度為 1.0mg/mL時,其清除羥自由基活性分別能達到56.20%(化學法)和 56.43%(酶法),說明所提取的蘋果渣黃酮有較強的抗氧化能力。

表7 化學法和酶法的比較

3 結論

植物的細胞壁由纖維素組成,而有效成分往往被包裹在細胞壁內。纖維素酶可以破壞細胞壁,從而使有效成分容易溶出[6]。本研究中先通過纖維素酶處理蘋果渣,再提取其中的黃酮類有效成分,結果表明,纖維素酶處理后的提取率明顯增加。并通過正交實驗得到纖維素酶提取的優化工藝條件為：pH =5.2、T=60℃、t=40min、E=0.2%。在優化條件下,酶法提取黃酮的提取率可達到 1.26%,與乙醇提取法相比,黃酮提取率有明顯提高。

對提取黃酮進行羥自由基清除實驗,發現酶法與化學法提取黃酮成分清除能力相似,表明兩種方法提取黃酮物質結構可能一樣。說明纖維素酶酶解提取蘋果渣黃酮時并不破壞其中的有效成分,纖維素酶可用來提取蘋果渣黃酮。

由于中藥材存在質地和成分的差異,因此將纖維素酶用于其廣泛的提取需要進一步深入研究。

[1]任靜,李多偉,王童文 .超聲萃取蘋果渣中總黃酮工藝的研究[J].中成藥,2003,25(9)：761-762.

[2]馬田田 .纖維素酶用于中藥提取的初步研究 .中草藥, 1994,25(3)：123-139.

[3]馬桔云,趙晶巖,姜穎,等 .纖維素酶在黃連提取工藝中的應用[J].中草藥,2000,31(2)：104.

[4]楊洋 .柚皮黃酮抗氧化機理及其含量的測定[J].廣西輕工業,2002(1)：36-38.

[5]張靜麗,王宏勛,張雯,等 .靈芝,枸杞多糖復合抗氧化作用[J].食品與機械,2004,20(6)：11-12,46.

[6]馮曉萍,查忠勇,王槐三 .銀杏葉黃酮提取工藝研究現狀[J].四川化工與腐蝕監控,2002,5(2)：13-17.

Study on extraction of flavanoid from apple pomace by cellulase and its antioxidation activities

WANG Yan-yan,L IU Tao,ZHANG Chong-yao,Y IN L in-lin,W U Guang-xu＊
(Life and Science College of Yangtze University,Jingzhou 434100,China)

In this p ap e r,the extrac tion cond itions of flavanoid from app le p om ace by ce llulose and its antioxida tion ac tivities we re inves tiga ted.The results showed tha t the yie ld of flavanoid from app le p om ace was highe r by us ing enzym e m e thod than by us ing trad itiona l chem ica lm e thod,the ob ta ining ra te of flavanoid inc reased from0.43% to 0.56%.In add ition,the orthogona l exp e r im entwas used to find the m os t suitab le extrac ted cond itions of flavanoid. And the op t im um cond itions we re as follows：ce llulase concentra tion was0.2%,pH was5.2,temp e ra ture and t im e for enzym e hyd rolys is was a t60℃ and40m in,resp ec tive ly.Unde r the op t im um cond itions,the extrac tion ra te of flavanoid from app le p om ace could reach1.26% by ce llulase,which was2.93t im es than tha t by us ing chem ica l m e thod.Add tiona lly,the extrac ted flavanoid us ing enzym a tic and chem ica l m e thods showed s im ila r antioxida tion ac tivity,which ind ica ted tha t ce llulase d id not des troy the comp onents of flavanoid.

ce llulase;flavanoid;app le p om ace

TS255.1

B

1002-0306(2010)02-0252-03

我國蘋果資源十分豐富,目前人們主要將其果肉用于飲料和釀造工業,而對其副產品蘋果渣很少利用。根據分析蘋果渣中含有多種黃酮類化合物,黃酮類物質有顯著的生理活性,如降血脂、降低膽固醇作用、清除自由基等,所以不斷將其應用于醫藥及保健食品行業[1]。近年來,纖維素酶逐漸應用于中草藥有效成分提取,如馬田田等[2]將纖維素酶用于黃柏小檗堿提取的預處理,小檗堿的收率可從 0.87%提高到 1.17%。本實驗將纖維素酶用于蘋果渣黃酮的提取,以蘋果渣中提取的粗黃酮重量、總黃酮重量、提取率為指標,對纖維素酶提取蘋果渣黃酮的工藝條件進行了初步優化,為酶法提取中藥材提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2008-11-26 ＊通訊聯系人

王巖巖(1980-),女,碩士,講師,主要從事食品生物技術教學及研究工作。