植物提取物對芒果致腐菌的抑制作用研究

李奧峰,黃 麗,滕建文,韋保耀

(廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004)

植物提取物對芒果致腐菌的抑制作用研究

李奧峰,黃 麗＊,滕建文,韋保耀

(廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004)

對植物提取物在抑制芒果病害領域進行了初步研究。以芒果褐色蒂腐菌 (Phomopsis mangiferae Ahmad)和膠孢炭疽菌(Collgtotrichum gloeosporioides Penz)為研究對象,采用管蝶法評價 30種植物的水提物和醇提物的離體抑菌效果。并使用孔板連續培養法測定相應的最低抑菌濃度(M IC)和最低殺菌濃度(MBC)。結果表明：有 14種水提物和 7種醇提物對芒果致腐菌有抑制作用。其中丁香、肉豆蔻、金銀花、知母、白芷、虎杖、烏梅、牡丹皮、黃連、藿香的水提物以及肉豆蔻、黃岑、大黃、桂皮、丁香的醇提物對膠孢炭疽菌均有抑制效果;丁香、桂皮、金銀花、牡丹皮、知母、肉豆蔻的水提物以及肉豆蔻、蘆薈、大茴香的醇提物對褐色蒂腐菌有不同程度的抑制作用。

植物提取物,芒果,褐色蒂腐菌,膠孢炭疽菌,抑菌

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芒果褐色蒂腐菌 (Phom opsis m angiferae Ahm ad)取自廣西大學農學院微生物保藏實驗室;芒果膠孢炭疽菌 (Collgtotrichum gloeosporioides Penz) 取自廣西農科院;30種植物的水提物和醇提物粉末 均購自西安和霖生物工程有限公司,均為標準制備工藝生產的天然植物提取物,分別是丁香、黃芩、桂皮、高良姜、大茴香、板藍根、金銀花、黃連、五倍子、藿香、厚樸、白芷、蘆薈、益母草、肉豆蔻、蒼術、苦參、魚腥草、百部、虎杖、黃連、白背葉、益智、山柰、三七、烏梅、鹿蹄草、龍膽草、大黃、牡丹皮。

YXQ-LS-5051型立式壓力蒸汽滅菌器,HDP-2000型恒溫培養箱,水平層流凈化工作臺,電冰箱,酒精燈,培養皿,試管,涂布棒,移液槍,12孔板,接種環,牛津杯,瓊脂粉,蔗糖等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的配制 取斜面培養的對數期生長旺盛的病原菌,吸取生理鹽水 20mL將斜面上孢子沖洗到三角瓶中,再加入 80mL生理鹽水加以稀釋,在洗斜面孢子時可用滅菌接種環適當刮洗。以此為菌懸液主液,制成一系列梯度濃度的標準菌懸液。將蓋玻片蓋在血球計數板計數室上面,用細口滴管吸取少量充分振蕩混勻的菌液,滴加在蓋玻片的邊緣上,讓菌液由蓋玻片與計數板的縫隙間滲入計數室,靜置片刻,待菌體自然沉降并穩定后開始計數。做 2次平行實驗,每次實驗做 3個重復,取平均值。最終獲得孢子含量為 106～107cfu/mL的菌懸液[5]。

1.2.2 管碟法測定植物提取物對芒果病原菌生長的抑制作用 吸取 200μL的指示菌菌懸液至 PDA平板上,用無菌玻耙涂布均勻,并用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養皿中,在水平放置的平皿中均勻地放置 3只牛津杯。用無菌水將提取物稀釋為 100mg/mL濃度的溶液,每種取 200μL至牛津杯中,對照組(CK)的牛津杯中加 200μL無菌水,陰性對照組 1 ()使用稀釋度為 1∶700的多菌靈,陰性對照組 2 ()使用稀釋度為 1∶700的撲海因,每種植物提取物進行三次平行實驗。注意不要將液體溢出牛津杯外,然后將平板置于最適生長溫度 28℃下培養,膠孢炭疽菌培養48h,褐色蒂腐菌培養60h,根據十字交叉法用游標卡尺測定抑菌圈的大小[6]。

1.2.3 孔板連續培養法測定植物提取物對芒果病原菌生長的最低抑菌濃度 (M I C)和最低殺菌濃度(MBC) 采用 12孔板連續稀釋法[7]。以無菌水為溶劑,配制一系列梯度濃度的提取物溶液,將該梯度濃度的提取物溶液加入已融化好的液體 PDA培養基中,在每一提取物濃度梯度作 3組平行實驗,向每個孔中依次加入 300μL的提取物溶液與培養基的混合溶液和 10μL的菌懸液。對照組 (CK)添加無菌水,陰性對照組 1()添加多菌靈,陰性對照組 2 ()添加撲海因,用保鮮袋封口,28℃下培養 48h,觀察結果,與三個對照組比較,有菌落生長者無抑制作用,以完全沒有菌生長的最低提取物濃度為其最低抑菌濃度(M I C),繼續培養36h后,取0.2mL涂布PDA平板,如仍不長菌的即為最低殺菌濃度(MBC)[8]。

2 結果與分析

2.1 管碟法測定植物提取物對芒果病原菌生長的抑制效果

采用 SPSS17.0的 Duncan Test及單因素方差分析對 1～30號提取物各自的抑菌效果進行分析,篩選出有效的提取物并記錄各自的效力,結果見表 1和表2。

由表 1可以看出,在 30種植物水提取物中,有抑制效果的有 14種。對膠孢炭疽菌有效用的有 10種,其中虎杖、知母、白芷具有等效的抑制作用 (同為 E級);烏梅、牡丹皮具有等效的抑制作用 (同為 D級);丁香水提取物的抑菌圈最大 (9.11mm),抑菌效果最好;丁香、肉豆蔻、金銀花、知母、白芷、虎杖、烏梅、牡丹皮、黃連、藿香對膠孢炭疽菌的抑制作用依次減弱。與對比實驗的兩種廣譜農藥的效果相比,丁香,肉豆蔻,金銀花的抑菌效果要稍好于撲海因,但是遠低于多菌靈。

表 1 植物水提物對芒果致腐菌的離體抑菌效果

表 2 植物醇提物對芒果致腐菌的離體抑菌效果

對褐色蒂腐菌有效用的水提取物有 9種,丁香、桂皮、金銀花、牡丹皮、知母、肉豆蔻、益智、黃岑、高良姜的抑制效果逐漸降低。丁香的抑菌效果最好,抑菌圈為 10.41mm。與對比實驗的兩種廣譜農藥的效果相比,丁香、桂皮、金銀花、牡丹皮、知母、肉豆蔻的效果比撲海因明顯,但是遠低于多菌靈。

由表 2可以看出,在 30種植物醇提物中,有 7種對芒果致腐菌有抑制作用。對膠孢炭疽菌有效用的有 6種,丁香、桂皮具有同樣的抑菌效果 (同為 D級);肉豆蔻、黃岑、大黃具有等效的抑菌效果 (同為E級);肉豆蔻醇提物的抑菌圈為 9.57mm,其抑菌效果最好;肉豆蔻、黃岑、大黃、桂皮、丁香、蘆薈的抑菌效果逐漸降低。與對比實驗的兩種廣譜農藥的效果相比,肉豆蔻、黃岑、大黃、桂皮、丁香這 5種醇提物的抑菌效果均比撲海因好,比多菌靈差。

對褐色蒂腐菌有效用的醇提取物有 3種,肉豆蔻、蘆薈、大茴香的抑制效果逐漸降低;肉豆蔻的抑菌效果最好,抑菌圈為 14.25mm。與對比實驗的兩種廣譜農藥的效果相比,肉豆蔻、蘆薈、大茴香的效果明顯比撲海因高,但是稍低于多菌靈。

實驗結果表明,不同種類植物提取液對同一芒果致腐菌的抑制作用存在著差異,同一植物用不同溶劑提取得到的物質對同種病原菌的抑菌活性亦存在較大差異。對于供試相同質量濃度的植物提取液,對褐色蒂腐菌的抑制作用明顯強于膠孢炭疽菌,說明兩種芒果致腐菌的生命力和抗藥性存在顯著性差異。

2.2 孔板培養法測定有抑菌效果的植物提取物的M IC、MBC

在上述實驗的基礎上,篩選出對褐色蒂腐菌和膠孢炭疽菌有抑制效果的植物提取物,對其最低抑菌濃度(M I C)和最低殺菌濃度 (MBC)進行測定,結果如表 3和表 4所示。

表 3 有效的植物水提物對芒果致腐菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度

表 4 有效的植物醇提物對芒果致腐菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度

由表 3可以看出,在對褐色蒂腐菌有抑制效果的水提物中,褐色蒂腐菌對丁香和肉豆蔻最為敏感,其最低抑菌濃度最小,為 50mg/mL;桂皮、金銀花、牡丹皮水提物的最低抑菌濃度同為 100mg/mL,其中金銀花的最低殺菌濃度大于 200mg/mL。在對膠孢炭疽菌有抑制效果的水提物中,丁香、金銀花、肉豆蔻、烏梅的最低抑菌濃度最小,同為 50mg/mL;金銀花的最低殺菌濃度最小。

由表 4可以看出,在對褐色蒂腐菌有抑制效果的醇提物中,肉豆蔻、黃岑、大黃醇提物的最低抑菌濃度最小,同為 25mg/mL,并且肉豆蔻醇提物的最低殺菌濃度最小。丁香、桂皮醇提物的最低抑菌濃度同為 50mg/mL,最低殺菌濃度同為 100mg/mL。可見褐色蒂腐菌和膠孢炭疽菌均對肉豆蔻醇提物最為敏感。

多菌靈對這兩種芒果致腐菌表現出了極高的殺菌效力,其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度均為本實驗的最小稀釋濃度。

3 結論

本研究通過對芒果膠孢炭疽菌的離體抑菌實驗,篩選出了對其有抑菌效果的 10種水提物和 6種醇提物。水提物的抑菌效果強度由強到弱為：丁香、肉豆蔻、金銀花、知母、白芷、虎杖、烏梅、牡丹皮、黃連、藿香;醇提物對膠孢炭疽菌的抑菌效果強度由強到弱為：肉豆蔻、黃岑、大黃、桂皮、丁香、蘆薈。通過對芒果褐色蒂腐菌的離體抑菌實驗,篩選出了對其有抑菌效果的 9種水提物和 3種醇提取物。水提物的抑菌效果強度由強到弱為：丁香、桂皮、金銀花、牡丹皮、知母、肉豆蔻、益智、黃岑、高良姜;醇提物的抑菌效果強度由強到弱為：肉豆蔻、蘆薈、大茴香。褐色蒂腐菌和膠孢炭疽菌均對肉豆蔻醇提物最為敏感,當肉豆蔻醇提物的濃度為 25mg/mL時,可殺死全部的芒果致腐菌。

同一種植物用不同的溶劑進行提取,獲得的有效抑菌成分也不盡相同,如本實驗中肉豆蔻的醇提物的抑菌效果遠好于其水提物。而大黃水提物對膠孢炭疽菌的沒有抑制作用,而醇提物對其抑制作用卻很明顯。原因可能是用水提取的生物堿鹽、甙類、有機酸類、氨基酸、多糖類等物質比較雜,有些物質對真菌的抑制能力不強;而醇提取的鹽、甙類、揮發油及有機酸類的活性物質能侵入微生物的細胞質膜,使其細胞膜蛋白質結構遭到破壞,抑制了微生物的 TCA呼吸途徑中酶的活性,阻斷了糖代謝途徑,使其不能生長繁殖。

在篩選天然植物保鮮劑時,不能只注重室內抑菌實驗篩選結果,離體實驗中抑菌作用強的提取物保鮮劑,對芒果活體采后病害的防治效果卻很難預料。因此有必要結合其在采后防腐的實際應用效果,對天然植物的抗菌作用機理、構效關系、化學仿生合成等進行細致深入的研究。用植物中提取有抑菌作用的活性物質,直接或間接加工合成的新型保鮮劑,使其具有在環境中生物降解快,對人畜及非靶標生物毒性低,不易產生抗性等優點,為天然植物提取物在果蔬保鮮方面的真正實踐應用提供基礎。

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Study on inhibition effect of plant extracts againstm ango pathogens

L IAo-feng,HUANG L i＊,TENG Jian-wen,W EI Bao-yao
(Institute ofLight Industry and Food Engineering,GuangxiUniversity,Nanning 530004,China)

The s tudy eva lua ted the ant im ic rob ia l ac tivity of30kinds of p lants’wa te r extrac ts and e thanol extrac ts aga ins t Phom op s is m ang ife rae Ahm ad,Collg totrichum g loeosp orioidesPenz by cup-p la te m e thod in vitro exp e r im ents.O rifice Pla te continuous culture m e thod was used to de te rm ine the irm in im um inhib ition concentra tion (M IC)and m in im a l bac te ric ida l concentra tion(MBC).In vitro exp e r im ents showed tha t14kinds of p lants’wa te r extrac ts and 7kindsof e thanol extrac tshad inhib ition effec tsaga ins t Phom op s is m ang ife rae Ahm adsand Collg totrichum g loeosp orioides Penz.Syringa,M yris tica,Lom ice ra,Rhizom a,Ange lica,Polygonum,Prunus,Cortex m outan,Cop tis,Agas tache’wa te r extrac ts as we ll as M yris tica,Scute lla ria,Rheum,C innam om um cass ia,Syringa’e thanol extrac ts had inhib ition effec ts aga ins t Collg totrichum g loeosp orioides Penz;Syringa,C innam om um cass ia, Lom ice ra,Cortex m outan,Rhizom a,M yris tica’wa te r extrac ts as we ll as M yris tica,A loe,Illic ium’e thanol extrac ts have inhib ition effec ts aga ins t Phom op s is m ang ife rae Ahm ad.

p lantextrac ts;m ango;Phom op s is m ang ife rae Ahm ad;Collg totrichum g loeosp orioides Penz; bac te ria l inhib ition

TS255.3

A

1002-0306(2010)03-0076-04

芒果極不耐貯運,采后易發生腐爛變質,長期以來,芒果的貯藏保鮮問題一直未能得到很好的解決,這不僅造成資源損失、環境污染,而且致使大量芒果收獲后無法進入全國性供應。由病原微生物引起的病理性病害是造成芒果腐敗變質的主要原因,芒果炭疽病和芒果蒂腐病是果生產區發生最普遍、危害性最大的一種病害,在我國各芒果種植區均有發生[1]。我國植物資源十分豐富,可供于開發利用的資源非常多。近年來,國內外對于有天然抗菌保鮮劑的應用研究十分盛行,Hammer[2]對 52種植物精油的抗菌活性進行了研究,發現巖蘭草油、胡荽、月見草、杏樹油、牛至、丁香等精油對金黃色葡萄球菌、黃曲霉菌等微生物有顯著的抑制作用。Ates[3]對幾種藥用植物提取液的抗菌活性研究中發現,桂皮提取液對芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等有抑制作用。孔秋蓮[4]等發現丁香、肉桂的提取物可抑制黑曲霉和擴展青霉的孢子萌發,五倍子、川芎的提取物可抑制黑曲霉和擴展青霉的孢子形成。通過查閱相關的文獻,選取了 30種抑菌效果較好的植物水提物和醇提物作為抑菌劑,進一步擴大了活性物質獲得的范圍。將芒果病害研究和天然植物提取物貯藏保鮮應用研究進行有機結合,從中篩選出有效的植物種類,解析抑菌效果,為研究這些提取物中的有效成分和活性物質,進一步篩選確定其化學成分和物質的結構奠定基礎,為克服芒果貯藏過程的病害發生以及開發天然芒果保鮮劑等提供理論依據。

2009-06-29 ＊通訊聯系人

李奧峰(1984-),男,碩士研究生,研究方向：亞熱帶水果蔬菜保鮮技術。

國家科技部攻關百色專項;廣西科技攻關項目 (桂科攻0424006-1D)。