烏司他丁對體外循環下心肌缺血再灌注損傷患者基質金屬蛋白酶-9的影響

孫 亮,劉 萍,常忠路,張衍魯,陳慶偉

體外循環(extracorporeal circulation,ECC)下心肌缺血再灌注損傷主要與鈣超載、氧自由基大量產生和內皮細胞激活有關。近年研究表明金屬蛋白酶(MMPs)的表達及活性增強,參與心肌缺血再灌注損傷的發展過程。在ECC期間如何防治心肌缺血再灌注損傷的發生發展一直為心臟外科醫師所關注。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一組鋅離子依賴性的蛋白水解酶家族,其主要功能是參與細胞外基質的降解,對于生理情況下細胞外基質動態平衡的維持有重要的作用。MMP-9是 MMP家族的重要成員,其主要功能是降解Ⅳ型膠原,與多種生理和病理過程有[1-2]。近年來,有關 MMP在ECC心肌缺血再灌注損傷中的作用逐漸受到重視。烏司他丁(ulinastatin,UTI)是一種廣譜的蛋白酶抑制劑,對胰蛋白酶、纖溶酶、激肽釋放酶等有較強的抑制作用,穩定溶酶體膜,從而抑制了多種炎性介質釋放對組織器官的損害,UTI對由于 ECC導致的各種蛋白酶及炎性介質對機體的損傷有明顯的抑制作用。本研究旨在探討 UTI對圍 ECC期患者血漿中MMP-9變化的影響。

1 對象與方法

1.1 試劑、藥品與器械 注射用 UTI(天普洛安,100 ku/支,粉針劑,廣東天普生物化學醫藥股份有限公司生產)。血漿 MMP-9含量采用 ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。Drager麻醉機 Fabius 2 000(德國 Drager公司生產的電動電控型)。StockertⅢ人工心肺機(Stockert公司,德國)和希健-Ⅰ膜式氧合器(西京公司,中國)。

1.2 對象及分組 收集本院心臟外科 2008年1月至 11月接受 ECC下行心臟手術的患者 30例,男 18例,女 12例。其中雙瓣置換術 10例,單瓣置換術12例,法洛四聯癥根治術 4例,冠狀動脈旁路移植術 4例。排除標準:術前有肝、腎功能障礙、糖尿病、系統性紅斑狼瘡及其他內分泌系統疾病、長期使用激素史、慢性支氣管炎、哮喘史、近期有肺部感染、ECC時間短于 30 min或長于 150 min者。以隨機概率表隨機分為 UTI組和對照組,每組 15例。UTI組按患者體重 12 ku/kg計算總用量,用 20m l生理鹽水稀釋后,在頸內靜脈插管成功后麻醉誘導時由頸內靜脈緩慢推入總量的 1/2,ECC開始時即刻將剩余量 1/2加入預充液中。相對應注入等量的生理鹽水作為對照組。

1.3 麻醉與ECC方法 所有患者術前常規禁食8 h,禁飲 6 h,麻醉前 30 min肌注嗎啡 0.1 mg/kg,東莨菪堿 0.007mg/kg。氣管插管、靜脈復合麻醉,麻醉誘導用藥為咪噠唑侖 0.03～0.05mg/kg,依托咪酯 0.3 mg/kg,舒芬太尼 0.6～1μg/kg,哌庫溴銨0.15mg/kg,麻醉維持采用靜脈方法,間斷靜注舒芬太尼,持續泵注異丙酚 3～5 mg/(kg·h),間斷追加哌庫溴銨維持肌松。麻醉成功后正中剖胸,肝素化(3mg/kg)至活化凝血時間(ACT)＞400 s,升主動脈及上、下腔靜脈置管常規建立 ECC,中或淺低溫(24～32℃),中度血液稀釋[紅細胞比容(Hct)為0.2～0.3],非搏動灌注,流量為 60～90m l/(kg·min)。心臟停搏液采用 4℃晶體高鉀停搏液于主動脈根部灌注,使心電呈等電位,心臟局部敷冰屑維持心肌局部深低溫。心內操作完成后左心排氣,開放升主動脈,復溫至36℃停止 ECC。常規用魚精蛋白 1：1比例拮抗肝素,必要時追加少量魚精蛋白。

1.4 標本采集與指標測定 分別記錄切皮至 ECC開始時間,ECC的時間,主動脈阻斷時間,手術時間,觀察術后患者的預后等。分別在 ECC開始前(T1)、主動脈阻斷前 1 Min(T2)、主動脈開放后 1 min(T3)、ECC結束時(T4)、ECC結束后 2 h(T5)及 6 h(T6)6個時間點各采集 5ml動脈血置于肝素化試管中,1 h內離心(3 000 r/min,10min),取血漿樣本置于-70℃下保存備用。標本復溫后集中按照試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)使用說明,采用 ELISA法檢測樣本中 MMP-9的濃度。測定值按 Taylor公式校正,公式為:

稀釋后物質含量校正值 =實測值 ×術前 Hct/取樣時 Hct

1.5 統計學方法 應用 SPSS 10.0統計軟件分析,所有計量資料用均數±標準差(±s)表示。組內比較采用重復測量數據方差分析,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 兩組患者臨床資料比較 兩組患者的年齡(44.2±10.6)歲 vs(45.1±11.3)歲 、男 /女性別比(9/6)例 vs(9/6)例、體重(54.7±10.3)kg vs(55.2±11.4)kg、手術類型(雙瓣置換術每組各 5例、單瓣置換術每組各 6例、法洛四聯癥根治術每組各 4例、冠狀動脈旁路移植術每組各 2例)、ECC時間(77.9±25.4)min vs(76.7±24.1)min、主動脈阻斷時間(55.3±18.7)min vs(57.1±19.2)min、手術時間(220.6±40.1)Min vs(230.9±45.7)min,均無統計學差異(P＞0.05)。

2.2 兩組患者不同時間點血漿 MMP-9濃度比較 所有患者術中經過順利,圍術期循環功能維持良好,兩組患者均無術后早期死亡。兩組患者MMP-9濃度在 T2、T3、T4、T5和 T6均較 T1時明顯升高(P＜0.05),均在 T4時達高峰。兩組MMP-9濃度在 T1時差異無顯著性(P＞0.05)。UTI組在 T2、T3、T4、T5和 T6時均明顯低于對照組(P＜0.05)。見表1。

3 討 論

目前 ECC下心肌缺血再灌注損傷仍是一個難以避免的并發癥,在 ECC期間如何防治心肌缺血再灌注損傷的發生發展一直為心臟外科醫師所關注。所以適當應用藥物干預對預防和減輕心肌缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義。

表1 兩組患者不同時點血漿MMP-9濃度(ng/L,n=15,±s)

表1 兩組患者不同時點血漿MMP-9濃度(ng/L,n=15,±s)

注:與對照組比較*P＜0.05;與T1比較#P＜0.05

對照組 50.8±11.2 80.6±21.5# 171.3±53.2# 403.9±132.3# 310.9±61.3# 142.3±48.6#UTI組 51.4±12.3 60.5±15.6*# 102.3±23.4*#213.8±71.6*# 122.9±30.3*# 73.2±18.7*#

MMP-9,又稱明膠酶 B,是 MMPs的主要成員,定位于人 16號染色體,它是 MMP家族中分子量最大的酶。分子量為 92 KDa大小,它以前酶原(80 KDa)的形式合成。含有一個 19個氨基酸的信號肽,后經裂解掉此信號肽,多糖氨基化而變成 92 KDa的酶原形式。92 KDa的酶原降解掉氨基酸端 73個氨基酸產生酶的活化形式(84 KDa)[3]。它作用底物廣泛,包括 Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型膠原、明膠、彈性蛋白等。MMP-9有 7個片段組成:信號肽片斷、一個裂解成激活酶的前肽片斷、鋅結合片斷、激活酶片斷、纖維連接片斷、類Ⅴ型膠原片斷、帶有羧基末端類血凝酶片斷,但這些片段的具體結構功能尚未明確[3]。在正常情況下,MMP-9釋放量很少[4]。

心肌缺血再灌注損傷主要與鈣超載、氧自由基大量產生和內皮細胞激活有關。近年研究表明MMPs的表達及活性增強,參與心肌缺血再灌注損傷的發展過程。Lu[5]等研究發現,體內豬心臟遭受 90 min的缺血,再灌注 90min后,心肌中的 MMP-9含量增加、酶活性增強,此與缺血再灌注心肌組織中MMPs組織抑制劑的含量減少及組織纖溶酶原激活物表達增高引起的瀑布效應有關。Romanic等[6]研究亦顯示 MMP-9基因缺失能有效的保護缺血再灌注對心肌損傷的影響。MMP-9基因缺失鼠在心肌缺血 30min再灌注 24 h后,心肌梗死面積比野生型鼠減少了 35.4%,內源性 MMP-9抑制劑的表達量是野生型鼠的 21.4倍。本實驗結果顯示,主動脈阻斷前 1min至 ECC后 6 h兩組患者 MMP-9濃度均較麻醉誘導前明顯升高,兩組均在主動脈開放后ECC結束時達高峰,其機制可能是因為心肌經受了缺血再灌注損傷的打擊而發生組織損傷,血管內皮組織損傷,或組織細胞產生大量的生物活性物質(組織因子、氧自由基、蛋白酶),促進全身炎癥反應并造成心肌組織損傷,這些都可能合成和釋放 MMP-9,成為 MMP-9增多的原因。這與先前的報道相一致。Lindsey等[7]通過動物實驗證實再灌注后 1 h MMP-9在血清及心肌組織中均增高,中性粒細胞浸潤是缺血再灌注損傷后 MMP-9的早期來源,在心肌層 MMP-9的一部分為激活型。中性粒細胞浸潤通過 MMP-9分泌型使 MMP-9聚集,是蛋白酶活化的來源。ECC過程中中性粒細胞激活釋放大量的 MMP-9,降解Ⅳ型膠原,破壞內皮基底膜,導致組織水腫,在 ECC中 MMP-9的釋放明顯增加[8]。

烏司他丁是由 Beuer和 Reich于 1909年在人類尿液中發現的一種典型的 Kuniz型蛋白酶抑制劑,具有兩個活性功能區。兩個活性功能區均有廣譜抑酶作用,且不完全重疊,能夠同時抑制胰蛋白酶、磷脂酶 A2、透明質酸酶、彈性蛋白酶等多種蛋白酶的活性。烏司他丁降解形成的分子產物仍對上述各種蛋白酶有高效抑制作用,能改善休克時的微循環狀態,對溶酶體膜有穩定作用。大量研究表明,UTI具有抑制多種蛋白、糖和脂類的水解酶的活性,抑制炎性介質的過度釋放及改善微循環和組織灌注的藥理作用,從而在 ECC中保護機體免受全身炎癥反應的損傷[9]。本實驗結果顯示,烏司他丁組主動脈阻斷前 1 min至 ECC結束后 6 h時 MMP-9的濃度均明顯低于對照組,說明烏司他丁在 ECC過程中可明顯抑制 MMP-9的過度釋放。其機制可能為:烏司他丁通過穩定溶酶體膜,抑制眾多酶活性,抑制粒細胞彈性蛋白酶和細胞自溶素 G,阻止中性粒細胞、單核粒細胞和巨嗜細胞聚集,預防細胞因子級聯反應,抑制白細胞過度激活及炎性介質的釋放,阻斷細胞因子、炎性介質與白細胞之間的惡性循環,從而抑制 MMP-9釋放和激活。Miura[10]也在研究中發現烏司他丁對由于 ECC介入而導致的各種蛋白酶及炎性介質對機體的損傷有明顯的抑制作用,應用烏司他丁后能明顯抑制腫瘤壞死因子-α的過度釋放,抑制中性粒細胞大量聚集和中性粒細胞脫殼粒作用,從而抑制 MMP-9的釋放。

本研究表明,ECC可致血漿中 MMP-9的濃度升高,而烏司他丁能明顯降低圍體外循環期患者 MMP-9的過度釋放,可能減輕心肌缺血再灌注損傷。

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