羥基脲對體外Hela細胞周期同步化作用的研究

王 昱,盧仲毅,許 峰,朱宇迪,朱宇熹

(1.第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院兒科,重慶400038;重慶醫(yī)科大學:2.兒童醫(yī)院急診科;3.兒童醫(yī)院藥劑科 400014;4.附屬第一醫(yī)院腫瘤科 400016;5.Department of Radiation Oncology&Ⅰmage-applied,Therapy Kyoto University Graduate School of Medicine,Japan)

羥基脲對體外Hela細胞周期同步化作用的研究

王 昱1,2,盧仲毅2,許 峰2,朱宇迪3,朱宇熹4,5△

(1.第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院兒科,重慶400038;重慶醫(yī)科大學:2.兒童醫(yī)院急診科;3.兒童醫(yī)院藥劑科 400014;4.附屬第一醫(yī)院腫瘤科 400016;5.Department of Radiation Oncology&Ⅰmage-applied,Therapy Kyoto University Graduate School of Medicine,Japan)

目的 探討利用羥基脲(HU)對 Hela細胞進行細胞周期同步化。方法 培養(yǎng) Hela細胞,采用 Hu處理 Hela細胞24 h,然后除去 HU,讓 Hela細胞進入細胞周期 G1、S、G2/M期,通過流式細胞術確認。結果 流式細胞儀檢測證實 Hela細胞在HU祛除后3.5 h處于S期,8.5 h處于 G2/M期,18 h處于 G1期。結論 HU處理可以有效地將 Hela細胞同步化于特定的細胞周期,而且方法簡單,易于操作。

羥基脲;Hela細胞;細胞周期;同步化

細胞增殖分裂是細胞基本的生理活動,細胞周期的紊亂導致許多疾病[1],各種調控因子通過作用于細胞周期而產生作用[2]。腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病之一,從細胞周期的角度出發(fā),探討不同細胞周期腫瘤細胞在侵襲和轉移過程中的細胞生物學特性的變化,可為腫瘤的治療提供定量的參考依據[1]。在體外細胞水平的研究中,將細胞同步化于特定的細胞周期,可以為各種細胞因子、藥物、放射的實驗提供理想的實驗對象[3]。為了研究某一時相細胞的代謝、增殖、基因表達或凋亡,常需采取一些方法使細胞處于細胞周期的同一時相,即細胞同步化技術[4-5]。采用羥基脲(hydroxyurea,HU)這種DNA合成抑制劑可逆地抑制S期細胞DNA合成而不影響其他細胞周期運轉,最終可將細胞群體阻斷在 G1/S期交界處[6-7],然后將含 HU的培養(yǎng)基置換出來,釋放細胞后繼續(xù)培養(yǎng),按照Hela細胞的細胞周期分布在不同的時間段設計時程作流式細胞術檢測,以判斷細胞所處的周期。作者經過反復實驗建立了Hela細胞同步化的方法。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與試劑 Hela細胞株(HeLa human cervical epithelial adenocarcinoma cell line)購自 the American Type Culture Collection。于RPMI1640培養(yǎng)基(Promega含10%的熱滅活小牛血清、100 u/mL青霉素及100 u/mL鏈霉素)、37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)傳代。

1.2 根據 Hela細胞的細胞周期設計檢測細胞周期的時程Hela細胞的細胞周期分布是 S期9 h,G1期8 h,G2/M 4 h。Hu處理后的細胞處于 G1、S期的交界處,故設計時程為:HU釋放后立即以及 3.5、8.5、10、11.5、14、16、18、20、22、24 h。

1.3 細胞同步化方法

1.3.1 一次阻斷后釋放法 采取 HU處理24 h,阻斷后釋放的方法。其簡要步驟如下:培養(yǎng) Hela細胞至對數生長期、傳代、接種入6孔培養(yǎng)盤,濃度為5×104/mL,加入 HU至其終濃度為1 mmol/L,在上述條件下培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液,以PBS液清洗細胞后加入新鮮培養(yǎng)液,然后繼續(xù)培養(yǎng)至各個時間點。

1.3.2 兩次阻斷后釋放法 接種 Hela細胞入6孔培養(yǎng)盤,濃度為5×104/mL,采取 HU終濃度為1 mmol/L處理24 h,棄去培養(yǎng)液,以PBS液清洗細胞后加入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)10 h,然后再用 HU處理14 h,然后釋放 Hela細胞。把未用 HU處理的樣本作為對照。

1.4 同步率檢測

1.4.1 收集細胞 達到時間點后,棄上清液,1×PBS+EDTA清洗,0.02%EDTA、25%胰蛋白酶消化收集,PBS液沖洗,以70%乙醇固定,置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 流式細胞儀檢測 流式細胞術PI染色技術,流式細胞儀(BD Bioscience)檢測各時相中細胞的比例,每次分析1×104個細胞,應用 Cell Quest software(BD Bioscience)分析軟件分析。

2 結 果

分別采用一次阻斷和兩次阻斷法阻斷后,測定立即以及3.5、8.5 h的結果。結果顯示兩次阻斷法相對于一次阻斷法步驟較復雜,處理的時間太長,使細胞容易過度生長。就FACS的結果來說 HU一次阻斷法后細胞周期的阻斷效果好,因此就采用一次阻斷法繼續(xù)研究。一次阻斷法后8.5、10、11.5 h 3個時間點的細胞周期分布見圖1。兩次阻斷法后18、20、22 h 3個時間點的細胞周期分布。18 h時間點,細胞主要在 G1期(圖2)。綜合各個時間點的流式細胞儀分析,3.5、8.5、18 h 3個時間點,細胞主要在S期、G2/M期和 G1期(圖3)。

圖1 HU一次阻斷法+8.5、10、11.5 h

圖2 HU一次阻斷法+18、20、22 h

圖3 HU處理同步 Hela細胞于 G1、S、G2/M期

3 討 論

細胞的增殖分裂受生長因子、激素及癌基因產物影響,從而影響細胞周期的運行。當調控因子造成細胞周期的快速運行,將導致良性或惡性的增生;而細胞周期停滯不前則導致細胞衰老、凋亡。因此,觀察各種調控因子對細胞周期運轉的影響和從細胞周期的角度來觀察調控運轉對細胞的增殖、分裂、凋亡等行為的影響非常重要。體外培養(yǎng)細胞同步化法是重要的研究細胞周期的方法,其基本原理是使細胞停止在細胞周期的某一時相,目前已廣泛應用于細胞動力學、人類高分辨染色體、成熟前積聚染色體以及細胞不同時相對藥物敏感性等方面的研究。哺乳動物細胞和人體細胞的同步化方法,包括溫度休克、照射、胰酶消化、藥物抑制、機械振動收集分裂細胞等,且常常需要幾種方法聯合應用,以同步細胞到特定的細胞周期。

細胞周期特異性的抗癌藥物抑制細胞周期的機制是特異性阻斷細胞周期的特定階段,例如阻斷S期的 HU、甲氨蝶呤等;阻斷M期的有紫杉醇、秋水仙素等。HU是尿素的羥基化產物,相對分子質量為76 u,是用于臨床的核糖核苷酸還原酶抑制劑類抗腫瘤藥物,可以阻止核苷酸還原為脫氧核苷酸,因而選擇性地抑制DNA的合成,并能直接損傷DNA。因本品作用于S期,并能使部分細胞阻滯在 G1/S期的邊緣,故可用作使腫瘤細胞部分同步化或放射增敏的藥物[8]。本研究采用HU阻斷 Hela細胞的細胞周期,然后釋放,Hela細胞就隨著釋放后的時程,進入各個細胞周期,經過多次重復的實驗,細胞的同步率均能穩(wěn)定,細胞的同步水平幾乎不會改變,表明這一同步化法能夠滿足實驗條件的要求。

HU作為臨床上治療慢粒、真性紅細胞增多癥的主要用藥之一[9],對頭頸部原發(fā)性鱗癌、復發(fā)性轉移性卵巢癌等亦有一定療效[10],還可作為放射增敏劑增加放療對頭頸部腫瘤的療效[11-12]。目前在臨床上,放、化療的時程安排仍然是有待解決的問題。放療對 G2/M期細胞敏感,對S期細胞不敏感,如果時程安排不當,可能造成放、化療的作用相拮抗[13-14],從而降低治療腫瘤的療效。如何才能達到最佳的協(xié)同效果,合理安排放、化療的時程非常重要[15]。將 HU作用于腫瘤細胞(Hela細胞)24 h,然后系統(tǒng)地用流式細胞儀觀察其對 Hela細胞周期的影響,對于安排放、化療時程能夠起到參考作用。本課題下一步將就HU同步化動物在體實驗進行研究,以期為臨床治療提供更有價值的依據和指導。

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Synchronization of the cell cycle of Hela cell by hydroxyurea in vitro

WANG Yu1,2,LU Zhong-yi2,XU Feng2,et al.
(1.Department ofPediatric,the Southwest Hospital,the Third military Medical University,Chongqing400038,China;2.Department of Emergency,Chongqing Medical University Affiliated Children′s Hospital,Chongqing400014,China;3.Department ofPharmacology,Chongqing Medical University Affiliated Children′s Hospital,Chongqing400014,China;4.Department of Oncology,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing400016,China;5.Department of Radiation Oncology&Image-applied,Therapy Kyoto University Graduate School of Medicine,J apan)

Objective To explore the method to synchronize Hela cell by hydroxyurea.Methods Culture Hela cell,add HU 1 nm to the culture medium,synchronized the Hela cell for 24 h,then release HU from the culture medium.Design the specific time course for Hela cell;proved by flow cytometry.Results After release HU,3.5 h later,Hela cell could be synchronized in S phase,8.5 h later in G2/M phase,and 18 h later in G1phase.Conclusion Hela cell can be successfully synchronized in G1,S,G2/M phase by the HU treatment and releasing.

hydroxyurea;hela cell;cell cycle;synchronization

10.3969/j.issn.1671-8348.2010.24.012

R329.28;R979.1

A

1671-8348(2010)24-3331-02

△通訊作者,E-mail:zhuyuxi17@hotmail.com。

2010-06-23

2010-08-25)