動態高壓微射流技術對可溶性大豆多糖結構的影響

章文琴，劉成梅,*，劉 偉，萬 婕

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2. 南昌大學中德食品工程中心，江西 南昌 330047)

動態高壓微射流技術對可溶性大豆多糖結構的影響

章文琴1,2，劉成梅1,2,*，劉 偉1,2，萬 婕1,2

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2. 南昌大學中德食品工程中心，江西 南昌 330047)

研究動態高壓微射流技術(DHPM)處理對可溶性大豆多糖(SSPS)組分、相對分子質量、外觀形態及單糖組成的影響。結果表明：經DEAE-Cellulose離子交換從大豆粗糖中純化得到SSPS-1和SSPS-2兩個組分，高效凝膠滲透色譜(HPGPC)分析表明SSPS-1為含少量蛋白的雜多糖，SSPS-2為高結合蛋白含量的單一多糖；SSPS-1經DHPM處理后，相對分子質量由7.33×105減少至5.11×105；電鏡掃描觀察其形貌由針狀排列結構變成末端膨大呈球形的“火柴棒”狀有序排列結構；氣相色譜分析單糖組成表明：SSPS-1主鏈中單糖L-鼠李糖和D-半乳糖醛酸的含量分別降低9.4%、17.1%，側鏈部分的單糖L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-巖藻糖、 甘露糖分別降低14.3%、26.3%、41.7%、60%，而D-木糖、D-葡萄糖、葡萄糖醛酸未檢出。

動態超高壓微射流；可溶性大豆多糖；組分；相對分子質量；形貌

可溶性大豆多糖(SSPS)是從大豆子葉中提取得到的 商業食品添加劑[1]，具有高溶解性，pH值穩定性，低黏度以及優良的乳化特性[2]。SSPS不僅作為膳食纖維來源之一用于強化食品、醫藥和工業行業中，還作為一種功能性添加劑應用于食品中，比如在酸奶中用于穩定劑[3-4]。

可溶性大豆多糖的提取方法主要有高溫水提法、酸堿法和酶法等。如Kawamura等[5]采用堿法從大豆中提取SSPS；Morita等[6]采用高溫熱提取法；Furuta等[7]采取了酸法提取；Huisman等[8]采用了半纖維素酶、鼠李糖酶及果膠酶提取SSPS。SSPS是一種酸性多糖，結構類似于果膠，含有同型多糖和異型多糖，分子量范圍在5×103～1×106D之間[9]。Nakamura等[10]分析了可溶性大豆多糖的分子組成，SSPS主要由D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸及L-鼠李糖組成。

通過對天然多糖進行結構修飾可改善其生理功能與理化特性，其中不乏通過物理方法降解多糖以達到改性目的的報道[11]。Tabata等[12]采用超聲波法降解多糖，證實超聲波降解只引起糖苷鍵的斷裂而不會改變葡聚糖的化學結構。Zhang等[13]采用超聲波降解水溶性大豆多糖，多糖的相對分子質量降低。Yang等[14]報道了龍眼多糖經超聲波處理后可提高其自由基清除能力；Yang等[15]報道采用超高壓技術對龍眼多糖處理后不會對其結構產生影響。

動態高壓微射流技術(dynamic high pressure microfluidization，DHPM)是一種新興的物理處理手段，其工作原理是通過高速碰撞、高頻振蕩、瞬時壓降、強烈剪切、氣穴作用等作用實現對物料的改性，可產生高達200MPa的壓力，且處理時間短(＜5s)、并能實現連續性操作，甚至改變大分子的結構[16-18]。本課題組在前期工作中研究表明大豆膳食纖維經其處理后，其可溶性膳食纖維含量得到了顯著提高[19-21]，Furuta等[7]研究表明可溶性酸性大豆多糖是大豆可溶性膳食纖維的主要成分，但目前對可溶性大豆多糖處理前后的組分、結構變化不清楚，限制了DHPM對大豆多糖改性機理的研究。

本實驗以SSPS為研究對象，討論處理后SSPS的組分、外觀形態、分子量及單糖組分的變化，以期為DHPM對SSPS的作用機理提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

75-1型大豆 江西省南昌市種子公司。透析袋(截留分子量3500D) 上海日初生物科技有限公司；超純水(Milli-Q50超純水儀制得)。

L-鼠李糖(L-Rha)、D-巖藻糖(D-Fuc)、L-阿拉伯糖(L-Ara)、D-木糖(D-Xyl)、甘露糖(Man)、D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、葡萄糖醛酸(GlcA)、D-半乳糖醛酸(D-GalA) 德國Merck公司及Sigma公司；氫氧化鈉(5 0%)、甲醇、己烷、肌醇、羥胺鹽酸、醋酸酐、吡啶、三氟乙酸(TFA) 上?；瘜W試劑公司；葡聚糖標準品(T-2000、T-500、T-150、T-100、T-70、T-40、T-10) Sigma公司；DEAE纖維素陰離子交換樹脂Sephadex G-75 Pharmacia公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

M-700型微射流均質機 美國Microfluidics公司；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；SBS-100數控計滴自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠；高效液相色譜儀 美國Waters公司；GC6890型氣相色譜儀 美國安捷倫公司；S-570電子掃描電鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 SSPS的提取與分離

根據Morita[6]的SSPS熱提法，稍作修改，具體流程如圖1所示。利用DEAE-Cellulose離子交換柱分離粗多糖，測定各管A620nm(蒽酮-硫酸法)，合并單一峰，得到SSPS-1和SSPS-2兩個多糖組分，透析凍干。其中蒽酮硫酸法根據Morris[22]多糖測定法進行。

圖1 可溶性大豆多糖提取、純化工藝流程Fig.1 Extraction and purification of soybean soluble polysaccharides

1.3.2 DHPM對SSPS的處理

將SSPS配成10mg/mL的溶液，采用微射流均質機在150MPa下分別對其處理4次，透析凍干。

1.3.3 SSPS相對分子質量測定

采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)對SSPS-1及SSPS-2進行純度及相對分子質量的測定。Waters高效液相色譜(配有UK6進樣閥，515泵頭，410示差折光檢測器，TU-1901UV-VIS型紫外分光檢測器)條件為：采用Ultrahydrogel-onliner凝膠柱(7.8mm×300mm)；流動相為超純水；標準品及樣品質量濃度均為2mg/mL；進樣量20μL，流速為0.6mL/min；柱箱、檢測器溫度均為30℃。測定葡聚糖標準品，繪制lgMw-tR標準曲線，根據線性回歸方程計算樣品的相對分子質量。

1.3.4 SSPS電鏡分析

參照周林等[23]的方法，將充分干燥精制多糖用蒸發鍍膜法制備電鏡樣品，置于掃描電鏡的樣品室中掃描分析，用隨機工作站進行拍攝，放大倍率600～1500倍，觀察多糖表面的形態。

1.3.5 SSPS單糖組成分析

1.3.5.1 SSPS樣品完全水解

根據張惟杰[24]酸水解方法，取2mg多糖樣品置于安培管中，加入1mol/L的硫酸2mL，真空封管100℃下反應4h，冷卻后將BaCO3粉末加入反應液中和至pH7，3000r/min離心5min，取上清液真空干燥至干。

1.3.5.2 乙酰化衍生物制備

根據Chen等[25]制備方法，取2mg樣品，加入2mL 2mol/L TFA，密閉，100℃水解6h，減壓抽干。在水解產物中加入20mg鹽酸羥胺和1mL吡啶，封管于90℃反應30min。冷至室溫，再加入1mL乙酸酐，封管于90℃反應30min，冷卻后轉出上層清液，減壓濃縮至干。滴入0.5mL氯仿溶解后進行氣相色譜分析。

采用內標法檢測，精密稱取內標物(L-鼠李糖、D-巖藻糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸及肌醇)各20mg，并按上述方法進行乙酰化，氯仿溶解后進行氣相分析。

1.3.5.3 色譜條件

GC6890氣相色譜儀配有FID檢測器，HP-5型毛細管柱(30m×0.32mm，0.25μm)，載氣為高純氮氣(1.0 mL/min)，進樣量0.5μL，分流比為19:1；進樣口溫度：250℃；程序升溫過程：180～200℃，6℃/min；200～220℃，3℃/min；220～240℃，3℃/min。

2 結果與分析

2.1 SSPS的分離純化

大豆經脫脂脫蛋白得到大豆粗多糖，由Sevag法除結合蛋白得到SSPS后進一步純化。采用DEAE-Cellouse纖維素柱對SSPS進行分級得到洗脫曲線如圖2所示。SSPS經Tris-HCl(0.01mol/L)-NaCl(0.1mol/L)洗脫后，得到兩個主要多糖組分SSPS-1(20～36管)、SSPS-2(92～100 管)。

通過大豆葡聚糖標準品(T-2000、T-500、T-150、T-100、T-70、T-40、T-10)進行液相分析得到相對分子質量的線性回歸方程為：lgMw= －0.2458tR+1.5746，R2=0.9954，以此計算樣品多糖相對分子質量。將得到的SSPS-1，SSPS-2分別進行高效液相凝膠色譜分析，得到相對分子質量圖譜如圖3、4所示。其中，SSPS-1含有5個單峰，經計算可知其相對分子質量分別為7.33×105、2.95×105、2.5×104、6223及1589，蛋白含量9.2%，為含少量蛋白的雜多糖；SSPS-2的相對分子質量為9.15×105，蛋白含量86.7%，為高結合蛋白含量的單一多糖。這一實驗所得多糖組分的相對分子質量要大于Furtura等[7]采用高溫熱水提取法制備的3種SSPS，其主要組分的相對分子質量是5.50×105、2.5×104、5×103。

圖2 SSPS經纖維柱純化后得到兩個峰SSPS-1、SSPS-2Fig.2 Purified SSPS-1 and SSPS-2 from SSPS through DEAE-cellulose ion exchange column

圖 3 SSPS-1相對分子質量圖譜Fig.3 Molecular weight of SSPS-1

圖 4 SSPS-2 相對分子質量圖譜Fig.4 Molecular weight of SSPS-2

為考察DHPM對多糖的影響，選取蛋白含量少的組分SSPS-1為下一步實驗對象。

2.2 DHPM對SSPS-1的組成及相對分子質量變化的影響

圖 5 經DHPM處理的SSPS-1、SSPS-2組分Fig.5 SSPS-1 and SSPS-2 treated by DHPM

SSPS經DHPM處理后得到的洗脫曲線見圖5，SSPS-1經處理后收集得到20～36管，相對未處理的SSPS-1總糖含量降低了1.9%；SSPS-2經處理后得到90～100管，相對未處理的SSPS-2總糖含量降低升高了1.6%。圖5中多糖吸收峰管數與圖2中一致，另外，多糖含量波動在2%，變化不明顯，表明DHPM處理沒有使得SSPS增加新的組分，亦基本沒有改變多糖含量。

圖 6 DHPM處理SSPS-1得到的相對分子質量圖譜Fig.6 Molecular weight of SSPS-1 treated by DHPM

圖6為 SSPS-1經DHPM處理后得到的多糖組分相對分子質量圖譜，其峰1(圖6左起)相對分子質量由7.33×105減少至5.11×105；峰2相對分子質量由2.95×105減少至2.13×105；峰3、峰4分子量分別由2.5×104、6223降低至2.2×104、5892；峰5(1589)處理后消失。同時，蛋白含量沒有出現很大的變化。出現這種現象的原因可能是SSPS-1經DHPM處理后，受到高速撞擊和剪切等作用力使得其部分糖鏈連接薄弱，甚至斷裂。峰5的消失可能是DHPM處理使部分小分子受作用力變成更加小分子量的糖，甚至單糖；或者小分子糖脫離了糖鏈以致在之后的透析過程中流失掉了。

2.3 DHPM對SSPS-1單糖組成變化的影響

按譚永輝[11]、Nakamura[26]等報道 SSPS含有相近數量的L-鼠李糖和D-半乳糖醛酸殘基，其主干半乳糖醛酸主鏈是由聚鼠李糖半乳糖醛酸長鏈和聚半乳糖醛酸短鏈構成；阿拉伯糖殘基占側鏈的21%，半乳糖殘基占側鏈的50%，在靠近聚鼠李糖半乳糖醛酸長鏈主干位點上的半乳糖短鏈被阿拉伯糖、戊糖、巖藻糖和葡萄糖修飾。

在本實驗中，測得SSPS-1的單糖組成及物質的量比為Rha:Fuc:Ara:Gal:Xyl:Glc:GlcA:GalA:Man=3.2:1.2:1.4:1.9:0.6:1.3:0.3:3.5:0.5(圖7)；SSPS-1經DHPM處理后，其單糖組成及物質的量比為Rha:Fuc:Ara:Gal:GalA:Man=2.9:0.7:1.2:1.4:2.9:0.2(圖8)。實驗結果表明經DHPM處理的SSPS-1主鏈的單糖Rha和GalA含量分別降低9.4%、17.1%，側鏈部分的單糖Ara、Gal、Fuc、 Man分別降低14.3%、26.3%、41.7%、60%，Xyl、Glc、GlcA則未檢出。

多糖降解程度的不同可能是DHPM處理后，L-鼠李糖和D-半乳糖醛酸構成的SSPS-1主鏈部分斷裂，阿拉伯糖及半乳糖為主要成分的側鏈上，其氫鍵作用力弱于DHPM的強作用力，使大部分側鏈脫離糖鏈，其他修飾多糖如巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖等亦有不同程度的脫離糖鏈現象，而多數小分子在之后的透析過程中流失。

圖 7 SSPS-1單糖組成氣相色譜分析圖Fig.7 Monosaccharide composition analysis of SSPS-1

圖 8 DHPM處理SSPS-1得到的單糖組成氣相色譜分析圖Fig.8 Monosaccharide composition analysis of DHPM-treated SSPS-1

2.4 DHPM對SSPS-1外觀形態變化的影響

SSPS-1經DHPM處理前后的掃描電鏡圖像如圖9所示，結果表明，SSPS-1呈針狀堆積排列，典型規格為50μm×3.57μm；SSPS-1經DHPM處理后，其外觀形態呈現出末端膨大呈球形的“火柴棒”狀有序排列結構，緊密簇擁，典型規格為20μm×3.6μm×4.3μm。

可溶性大豆多糖屬于天然高分子凝膠，糖鏈間通過氫鍵交聯；在劇烈環境下，多個可溶性大豆多糖分子以一定的形態相結合，多糖分子鏈間氫鍵的作用可使多糖分子發生自締合[27]。在本實驗中，SSPS-1在DHPM的強烈作用力下，可能導致其糖鏈間氫鍵斷裂，使得多糖的針狀結構末端暴露更多基團，從而出現分子斷裂變短現象；同時由于多糖暴露出更多基團，糖鏈間形成新的氫鍵交聯，形成新的緊密的“火柴棒”狀有序排列結構。

圖9 SSPS-1和SSPS-1經DHPM處理的掃描電鏡Fig.9 SEM of SSPS-1 and DHPM-treated SSPS-1

3 結 論

SSPS經過DHPM處理后，其相對分子質量，分子外觀形態及單糖組成均有變化。DHPM并不會增加多糖組分，其中進一步分級得到的組分SSPS-1的相對分子質量由(7.33×105)減少至(5.11×105)；分子外觀形態則由針狀排列變化成末端膨大呈球形的“火柴棒”狀有序排列；主鏈的單糖Rha和GalA含量分別降低9.4%、17.1%，側鏈部分的單糖Ara、Gal、Fuc、Man分別降低14.3%、26.3%、41.7%、60%， Xyl、Glc、GlcA未檢出。由此可知，DHPM的作用不會增加SSPS的新組分，而是使其分子氫鍵斷裂重組，側鏈斷裂，表現為分子量降低，單糖含量降低，其中主鏈降低程度小于側鏈。DHPM對SSPS的糖苷鍵的影響還需進一步探討，以得到DHPM對SSPS的具體作用機理。

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Effect of Dynamic High-pressure Microfluidization on Morphology of Soluble Soybean Polysaccharides

ZHANG Wen-qin1,2，LIU Cheng-mei1,2,*，LIU Wei1,2，WAN Jie1,2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The effect of dynamic high-pressure microfluidization (DHPM) treatment on compositions, morphology, component change of sugar and molecular weight of soluble soybean polysaccharides (SSPS) were investigated. Results showed that soybean soluble polysaccharides were treated by DHPM, and then purified by DEAE-cellulose ion exchange column to obtain two components, which were SSPS-1 and SSPS-2. High performance gel permeation chromatography (HPGPC) analysis exhibited that SSPS-1 was a heteropolysaccharide containing a small amount of protein and SSPS-2 was a homogeneous polysaccharide associated to protein with high molecular weight. The molecular weight of SSPS-1 was reduced from 733 to 511 kD by microfluidization treatment. Scanning electron microscopy observation of SSPS-1 showed that feature of DHPM-treated SSPS-1 sample was changed from the disordered flake-like to ordered "match stick"-like structure, which swelled into sphere at the end of structure. The major components, Rha and GalA, in the main chain of SSPS-1 exhibited a decrease by 9.4% and 17.1%, respectively. While the components such as Ara, Gal, Fuc and Man in side chain of SSPS-1 exhibited a significant reduction, which were decreased by 14.3%, 26.3%, 41.7% and 60%, respectively. There were no detectable Xyl, Glc and GlcA due to the break of chains and hydrolysis.

dynamic high-pressure microfluidization；soluble soybean polysaccharide；component；molecular weight；morphology

TQ929.2

A

1002-6630(2010)09-0030-05

2009-12-01

國家“863”計劃重點項目 (2007AA100403)；國家重點實驗室目標導向項目(SKLF-MB-200808)

章文琴(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食物(含生物質)資源開發與利用。E-mail：zhangwenqin1985@hotmail.com

劉成梅(1963—)，男，教授，博士，研究方向為食品工程高新技術。E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn