微波處理對(duì)枯草桿菌芽孢致死效果研究

黃 明，黃 峰，周興虎，邢 悅，周光宏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095)

微波處理對(duì)枯草桿菌芽孢致死效果研究

黃 明，黃 峰，周興虎，邢 悅，周光宏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095)

通過(guò)比較不同溫度和時(shí)間下微波和水浴對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢的致死效果，以探討微波殺菌的熱效應(yīng)與非熱效應(yīng)。枯草桿菌黑色變種芽孢活化后，制成104CFU/mL的孢子懸浮液，然后分別用微波和水浴加熱對(duì)芽孢進(jìn)行滅菌，最后測(cè)定滅菌后的單位體積菌落總數(shù)，計(jì)算致死率。結(jié)果表明，微波和水浴加熱在92℃時(shí)的致死率都高于85℃時(shí)的致死率。在相同的溫度和時(shí)間下，微波的殺菌效果好于水浴加熱，存在非熱效應(yīng)。只有在92℃，20min時(shí)，微波和水浴加熱對(duì)芽孢的致死率差異不顯著，非熱效應(yīng)不明顯。

微波；殺菌；熱效應(yīng)；非熱效應(yīng)；枯草桿菌黑色變種芽孢

微波是頻率在300MHZ～300GMZ的非電離輻射電磁波，具有穿透力強(qiáng)、能耗少、效率高、處理后無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)[1]，因此在果蔬、肉制品、乳制品等食品加工領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[2-4]。由于微波與生物體的相互作用是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程[5]，因此人們對(duì)微波的殺菌機(jī)理還不是很明確。早期的學(xué)者認(rèn)為微波的殺菌作用主要來(lái)自于其熱效應(yīng)[6-7]，其依據(jù)是微波殺菌在高溫時(shí)可致死大量微生物，而在低溫時(shí)滅菌效果明顯變差[8]。熱效應(yīng)解釋微波殺菌機(jī)理雖廣為接受，但其并不能解釋所有微波殺菌現(xiàn)象，如與水浴加熱等傳統(tǒng)殺菌方法相比，在致死一定量的微生物前提下，微波殺菌所需時(shí)間較短，溫度較低[9]。因此，有學(xué)者提出微波殺菌除熱效應(yīng)外，還存在非熱效應(yīng)，是兩者綜合作用的結(jié)果[10-11]。

目前，多數(shù)微波殺菌實(shí)驗(yàn)是以營(yíng)養(yǎng)體作為研究對(duì)象，而對(duì)于耐熱性較強(qiáng)的芽孢的研究相對(duì)還較少。汪保國(guó)等[12]采用微波對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間處理，微波對(duì)芽孢的致死率要高于水浴，并認(rèn)為微波殺菌存在著非熱效應(yīng)。但文中只描述了微波殺菌的時(shí)間，沒(méi)有考慮到溫度變化，而實(shí)際上溫度是對(duì)芽孢致死的一個(gè)重要因素，因此研究不同溫度和時(shí)間條件下微波對(duì)枯草桿菌芽孢(枯草桿菌芽孢是所有芽孢的典型代表)的致死作用對(duì)于闡述微波的非熱效應(yīng)具有重要的理論意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較水浴和微波照射對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢的致死效果，以探討微波殺菌的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草桿菌黑色變種芽孢ATCC9372中國(guó)科學(xué)院微生物所微生物菌種保藏中心；PCA平板計(jì)數(shù)瓊脂 路橋公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-E離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特公司；YQZG-03型微波殺菌機(jī) 南京永青食品保鮮科技發(fā)展有限公司；HH-42快速恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋 常州國(guó)華電器公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢制備

從營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面挑取枯草芽孢桿菌黑色變種并接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，在37℃培養(yǎng)24h，將接種好的平板進(jìn)行輪換培養(yǎng)(冰箱4℃，恒溫培養(yǎng)箱37℃，輪換周期為2d)1個(gè)月，然后觀察芽孢的數(shù)量變化，直到芽孢數(shù)量達(dá)到90%，方可制備芽孢懸液。

1.3.2 孢子懸浮液制備

用生理鹽水對(duì)芽孢平板進(jìn)行洗脫，將洗脫液裝入試管，然后在3500r/min的條件下離心10min，再進(jìn)行煮沸去除雜菌，從而得到孢子濃縮液。芽孢數(shù)量測(cè)定參考曾慶孝等[13]方法，并稍作修改。吸取10μL制得的濃縮液加入到9.99mL生理鹽水中，10倍遞減稀釋?zhuān)?7℃條件下培養(yǎng)24h，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。然后用生理鹽水稀釋成104CFU/mL的孢子懸液。向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入30mL，加蓋薄膜備用。

1.3.3 微波殺菌實(shí)驗(yàn)

在微波殺菌機(jī)的托盤(pán)兩側(cè)放入加有適量水的燒杯作為負(fù)載，然后把裝有孢子懸液的培養(yǎng)皿放入托盤(pán)中心，孢子懸液的溫度可由微波設(shè)備頂部的紅外探頭準(zhǔn)確測(cè)定。微波所采用的頻率為915MHz，殺菌溫度分別為85、92℃，殺菌時(shí)間分別為5、10、20min，實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理做4個(gè)重復(fù)。

1.3.4 水浴殺菌實(shí)驗(yàn)

使用恒溫水浴鍋進(jìn)行殺菌實(shí)驗(yàn)，殺菌溫度分別為85、92℃，殺菌時(shí)間分別為5、10、20min，實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理做4個(gè)重復(fù)。

1.3.5 致死效果檢驗(yàn)

吸取微波和水浴殺菌后的孢子懸液各1mL分別放入營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，在37℃的條件下培養(yǎng)24h，然后對(duì)平板進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)，并計(jì)算不同處理?xiàng)l件下的致死率。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件對(duì)不同處理?xiàng)l件下的致死率進(jìn)行分析，多重比較采用鄧肯氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度和時(shí)間下微波對(duì)枯草桿菌芽孢致死效果

圖1 不同溫度和時(shí)間條件下微波對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢的致死效果Fig.1 Lethal effect of microwave treatment on Bacillus subtilis var. niger at various heating temperatures and time

從圖1可以看出，和對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)微波照射的枯草桿菌黑色變種芽孢的菌落總數(shù)明顯減少，致死率差異極顯著(P＜0.01)。隨著殺菌時(shí)間的延長(zhǎng)，85℃和92℃條件下的微波對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢的致死率都逐步增大。在殺菌時(shí)間為5min和10min時(shí)，92℃時(shí)微波對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢的致死率要明顯大于85℃的致死率(P＜0.05)。但當(dāng)殺菌時(shí)間到20min時(shí)，兩溫度下的芽孢致死率差異不明顯(P＞0.05)。兩溫度條件下的致死率差值從5min時(shí)的7.7%到20min時(shí)的不足1%。2.2 不同溫度和時(shí)間下水浴對(duì)枯草桿菌芽孢致死效果

圖2 不同溫度和時(shí)間條件下水浴對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢的致死效果Fig.2 Lethal effect of water-bath heating treatment on Bacillus subtilis var. niger at various heating temperatures and time

由圖2可知，和對(duì)照組相比，水浴處理后枯草桿菌黑色變種芽孢的菌落總數(shù)明顯降低，致死率差異顯著(P＜0.01)。隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，85℃和92℃條件下的水浴對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢的致死率都逐漸增大。在20min的水浴時(shí)間內(nèi)，92℃條件下水浴對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢致死率都大于85℃的條件下的致死率(P＜0.05)，但隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，兩溫度條件下的致死率逐漸接近，致死率差值從5min時(shí)的6.5%到20min時(shí)的2.6%。2.3 微波照射與水浴加熱對(duì)枯草桿菌芽孢致死效果的對(duì)比分析

圖3 不同溫度和時(shí)間下微波照射和水浴加熱對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢的致死率對(duì)比分析Fig.3 Lethal rates of microwave and water-bath heating treatments on Bacillus subtilis var. niger at various heating temperatures and time

由圖3可以看出，在相同的加熱溫度和時(shí)間下，微波對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢的致死率要高于水浴對(duì)芽孢的致死率。85℃條件下，在整個(gè)加熱過(guò)程中，微波對(duì)芽孢的致死率始終高于水浴對(duì)芽孢的致死率(P＜0.05)。在92℃條件下，在加熱時(shí)間為5min和10min時(shí)，微波對(duì)芽孢的致死率始終高于水浴對(duì)芽孢的致死率(P＜0.05)，但當(dāng)加熱時(shí)間到20min時(shí)，兩者之間的差異不顯著(P＞0.05)，都接近于100%。

3 討 論

微波殺菌的生物效應(yīng)主要包括熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。熱效應(yīng)是指在微波電磁場(chǎng)中，物體極性分子因發(fā)生定向排列而相互摩擦升溫，從而致死微生物；非熱效應(yīng)則是微生物組成蛋白質(zhì)和生理活性物質(zhì)發(fā)生變異從而喪失活力或死亡[14-15]。熱效應(yīng)解釋微波殺菌機(jī)理已被普遍接受，而至于是否存在非熱效應(yīng)目前還沒(méi)有定論。一般認(rèn)為水浴加熱只產(chǎn)生熱效應(yīng)，因此可以通過(guò)比較微波和水浴的殺菌效果來(lái)探討微波殺菌的非熱效應(yīng)。

目前常用的微波頻率主要有2450MHz和915MHz，前者穿透力強(qiáng)，主要用于干燥、解凍等，后者加熱能力強(qiáng)，常用于殺菌[16]。傳統(tǒng)的微波設(shè)備一般只有升溫過(guò)程，難于準(zhǔn)確測(cè)定殺菌溫度和時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)所用微波殺菌設(shè)備具有紅外測(cè)溫系統(tǒng)，可以保證殺菌溫度和時(shí)間的準(zhǔn)確性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，微波殺菌溫度越高，微波對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢的致死效果也越明顯，這種現(xiàn)象表明微波殺菌熱效應(yīng)的存在。而在相同溫度與時(shí)間下，微波對(duì)枯草桿菌黑色變種芽孢的致死率要高于水浴，這說(shuō)明微波對(duì)芽孢的致死作用除了熱效應(yīng)外，還存在非熱效應(yīng)，是兩者綜合作用的結(jié)果。

[1] 李里特. 微波在食品加工中應(yīng)用的原理和特點(diǎn)[J]. 食品工業(yè)科技,1991(6): 3-7.

[2] TANG Zhongwei, MIKHAYLENKO G, LIU Fang, et al. Microwave sterilization of sliced beef in gravy in 7-oz trays[J]. Journal of Food Engineering, 2008, 89(4): 375-383.

[3] 郭建中, 郝玉書(shū). 微波能在食品工業(yè)中的應(yīng)用與發(fā)展[J]. 廣州化工,2000, 28(4): 46-48.

[4] NUNES A C, BOHIGAS X, TEJADA J. Dielectric study of milk for frequencies between 1 and 20GHz[J]. Journal of Food Engineering, 2006,76(2): 250-255.

[5] 杭鋒, 陳衛(wèi), 龔廣予, 等. 微波殺菌機(jī)理與生物學(xué)效應(yīng)[J]. 食品工業(yè)科技, 2009(1): 333-337.

[6] GOLDBLITH S A. Basic principles of microwaves and recent developments[J]. Advances in Food Research, 1966, 15: 277-301.

[7] CARROLL D E, LOPEZ A. Lethality of radio-frequency energy upon microorganisms in liquid, buffered, and alcoholic food systems[J]. Journal of Food Science, 1969, 34(4): 320-324.

[8] MERVINE J, TEMPLE R. Using a microwave oven to disinfect intermittent-use catheters[J]. Rehabilitation Nursing: the Official Journal of the Association of Rehabilitation Nurses, 1997, 22(6): 318-320.

[9] 王曉慶.微波滅菌機(jī)理研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2008: 4-8.

[10] 席曉莉, 金友煌. 高功率微波對(duì)細(xì)菌殺滅效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2000, 17(2): 231-232.

[11] VARDAXIS N J, HOOGEVEEN M M, BOON M E, et al. Sporicidal activity of chemical and physical tissue fixation methods[J]. British Medical Journal, 1997, 50(5): 429-433.

[12] 汪保國(guó), 張冠群, 伍碧雯, 等. 微波消毒法與水浴加熱法殺菌效果的對(duì)比研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 1996, 12(3): 178-180.

[13] 曾慶孝, 芮漢明, 李汴生.食品加工與保藏原理[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2002: 240-266.

[14] 余愷, 胡卓炎, 黃智洵, 等. 微波殺菌研究進(jìn)展及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 食品工業(yè)科技, 2005, 26(7): 185-189.

[15] 辛志宏, 馬海樂(lè). 微波技術(shù)在食品殺菌與保鮮中的應(yīng)用[J]. 糧油加工與食品機(jī)械, 2000(4): 30-32.

[16] 李建忠. 微波對(duì)食品微生物的非熱生物效應(yīng)與微波殺菌技術(shù)[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 32(6): 1219-1222.

Lethal Effect of Microwave Treatment on Bacillus subtilis var. niger Spores

HUANG Ming，HUANG Feng，ZHOU Xing-hu，XING Yue，ZHOU Guang-hong
(National Center of Meat Quality and Safety Control, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to explore the thermal effect of microwave sterilization, lethal effects of microwave and water-bath heating treatments on Bacillus subtilis var. niger spores were compared at various heating temperatures and time. After the activation of Bacillus subtilis var. niger spores, the spore suspension at the concentration of 104CFU/mL was prepared. Microwave and waterbath heating treatments were used for the sterilization of spores to evaluate the lethal rate. Results indicated that the lethal rate at 92 ℃ was higher than that at 85 ℃ for both microwave and water-bath heating treatments. At the identical condition of heating temperature (85 ℃) and time, the lethal effect of microwave treatment was much better than that of water-bath heating treatment,which was due to an obvious non-thermal effect. However, no obvious difference in lethal rates of microwave and water-bath heating treatments at 92 ℃ for 20 min was exhibited.

microwave；sterilization；thermal effect；non-thermal effect；Bacillus subtilis var. niger spore

Q93.334

A

1002-6630(2010)09-0027-03

2009-09-14

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA100804-5)；江蘇省青藍(lán)工程項(xiàng)目(蘇教師2008-30)；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(SBC200960038)

黃明(1970—)，男，副教授，博士，主要從事肉品質(zhì)量與安全控制研究。E-mail：mhuang@njau.edu.cn