大腸桿菌O157:H7膠體金試紙條研制

黃嶺芳，段 霞，陳 媛，劉文娟，魏 華，賴衛華,*

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西中德生物工程有限公司，江西 南昌 330029)

大腸桿菌O157:H7膠體金試紙條研制

黃嶺芳1，段 霞1，陳 媛2，劉文娟2，魏 華1，賴衛華1,*

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西中德生物工程有限公司，江西 南昌 330029)

采用膠體金標記抗大腸桿菌O157:H7單克隆抗體(鼠源)，通過將大腸桿菌O157:H7多克隆抗體和驢抗鼠抗體(二抗)噴涂于硝酸纖維素膜分別作為檢測線和質控線，研制大腸桿菌O157:H7膠體金快速檢測試紙條。通過優化實驗，確定最佳條件為標記量16.8μg/mL、標記pH8.0、封閉劑PEG20000、檢測時樣品最佳pH7.0～7.5。對26株常見細菌交叉反應結果表明，該試紙條除與鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311和金黃色葡萄球菌CMCC 26003有輕微交叉反應外，與其他24株菌均無交叉反應。該試紙條靈敏度為104CFU/mL。用該試紙條檢測大腸桿菌O157:H7操作簡便、快捷、靈敏度高、特異性強。

大腸桿菌O157:H7；膠體金；試紙條

大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一種常見的、重要的人畜共患致病菌。它可以引起多種疾病，如出血性結腸炎(hemorrhagic colitis)、溶血性尿路綜合癥(haemolytic uremic syndrome)[1-3]和血栓性血小板紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura)[4]等，它的感染劑量非常低，食入不足10個細菌就可引起疾病[5]。1982年美國第一次發現E.coli O157:H7，隨后在美國、英國、加拿大、日本、澳大利亞和德國等地均有此菌感染事件的報道。我國受該菌的威脅也越來越大，2005年鄭州市內發現3例E.coli O157:H7感染病例[6]；據調查河南省波爾山羊的帶菌率最高達到29.8%[7]；張亞利等[8]對河北省1998年1月1日至1999年12月31日住院病例進行調查，發現有41例E.coli O157:H7感染疑似病例；徐景野等[9]從2001年一名男性腹瀉患者糞便中分離得到E.coli O157:H7；陳岡等[10]對上海地區4家豬場的飼料、飲水、土壤、糞便以及空氣112份樣品進行檢測，在糞便及土壤中均有E.coli O157:H7檢出，其中E.coli O157:H7總陽性率為2.68%；朱根忠等[11]對在江蘇省建湖地區2008年5月至9月采集腹瀉患者、家禽和家畜的糞便以及水源水、肉制品、蒼蠅等836份樣本進行鑒定，檢出腸出血性大腸桿菌O157:H7陽性標本17份；馮艷潔等[12]對秦皇島食品中E.coli O157:H7污染情況進行監測，從220份食品中檢出2株大腸桿菌O157:H7，檢出2株可疑的大腸桿菌O157:H7。因此，建立快速準確靈敏的檢測方法，對于診斷E.coli O157:H7引起的食物中毒及預防該菌引起食物中毒均有重要意義。

1971年Faulk等創立免疫膠體金技術以來，由于該技術有方便快捷、特異敏感、穩定性強、不需要特殊設備和試劑、結果判斷直觀等優點，得到廣泛的應用。本研究擬以雙抗夾心為模型，研制E.coli O157:H7膠體金試紙條，并對試紙條進行靈敏度和特異性評價。

1 材料與方法

1.1 菌株與抗體

E. coli O157:H7(CMCC 44828) 中國醫學細菌保藏管理中心；其他菌株為本實驗保存；兔抗E.coli O157:H7多克隆抗體由本實驗室制備；鼠抗E.coli O157:H7單克隆抗體 Meridian公司。

1.2 試劑與儀器

氯化金(HAuC14) 天津市福晨化學試劑廠；檸檬酸三鈉 北京化工試劑公司；硝酸纖維素膜、吸水紙、樣品墊、結合墊、PVC底板 Millipore公司；PEG20000 Simga公司；BSA 北京新經科生物公司；驢抗鼠IgG無錫中德伯爾生物技術有限公司。

紫外分光光度計 上海棱光技術有限公司；Biodot點樣儀、試紙條切刀 Biodot公司；磁力攪拌器 江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠。

1.3 細菌培養

將－80℃保存E. coli O157:H7劃線接種于山梨醇麥糠凱平板上，37℃培養18h后挑取典型菌落接種于液體LB培養基中，37℃搖床培養8h。長雙歧桿菌等厭氧細菌劃線接種于MRS平板上，37℃厭氧培養24h，挑取單菌落于液體MRS中，37℃靜置培養16h。其他細菌劃線接種于LB平板上，方法同E. coli O157:H7。各種菌均用生理鹽水梯度稀釋后進行菌落計數。

1.4 膠體金試紙條制備

1.4.1 膠體金制備

膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法。將100mL 0.01% HAuCl4溶液加熱煮沸，然后立即加入1.2mL 1%檸檬酸三鈉溶液攪拌，溶液的顏色由淺黃→藍色→深藍→紅色，當溶液的顏色完全變為透明的紅色時，繼續回流10min后停止加熱，冷卻至室溫，4℃保存。

1.4.2 標記pH值的確定[13]

取7個2mL離心管，分別加入1mL膠體金溶液，用0.2mol/L K2CO3溶液將pH值分別調為5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，各取100μL上述不同pH值的膠體金加入96孔板中，每孔加入10μL 1mg/mL的抗E.coli O157:H7單克隆抗體，混勻，靜置5min后，每孔加入20μL 100g/L NaCl溶液，混勻，室溫條件下放置10min，觀察膠體金顏色變化，保持紅色的pH值即為合適的標記pH值。

1.4.3 最佳標記量的確定

最佳標記量以目測法確定[14-15]。將待標記的抗E.coli O157:H7單克隆抗體逐級稀釋后，各取10μL加入一系列裝有100μL pH8.0膠體金的離心管中，搖勻室溫放置5min后，分別加入10μL 100g/L NaCl，依次按表1進行，混勻靜置2h以上觀察結果。保持紅色的離心管中，所含最低蛋白量(穩定1mL膠體金的必須蛋白量)的120%即為實際用量。

1.4.4 封閉劑的確定

取5個50mL潔凈燒杯，分別加入10mL膠體金，用0.2mol/L K2CO3溶液調節pH8.0，分別加入1mL 168μg/mL抗E.coli O157:H7單克隆抗體，攪拌30min，其他試劑按表2加入，4℃、5000r/min離心30min，沉淀用重懸液重懸。用點樣儀將重懸液點樣于結合墊上(8μL/cm)，真空干燥1～2h，將已純化抗E. coli O157:H7多克隆抗體用pH7.2的PBS稀釋至0.5mg/mL，點樣于硝酸纖維素膜上(1μL/cm)，37℃干燥4～5h。將濾紙、樣品墊、結合墊和硝酸纖維素膜、吸水紙固定于PVC底板上，依次加入液體LB、PBS及108CFU/mL E. coli O157:H7培養液，10～15min后讀取結果。

表2 封閉劑的確定Table 2 Design for the optimization of blocking reagents

表1 抗體最佳標記量確定Table 1 Design for the optimization of antibody label amount

1.4.5 樣品最佳pH值確定

將PBS的pH值分別調至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，各取100μL加入試紙條中，10～15min后讀取結果。

1.4.6 試紙條特異性

將培養好的各種細菌用p H 7.2的P B S稀釋至107CFU/mL，分別取100μL用試紙條檢測，并用pH7.2的PBS和液體LB作為陰性對照。

1.4.7 試紙條靈敏度

將E. coli O157:H7培養液用pH7.2的PBS稀釋成103～107CFU/mL，分別加入試紙條中，并用pH7.2的PBS和液體LB作為陰性對照，10～15min后讀取結果。

1.5 食品樣品檢測

市售萵苣、牛肉接種目的菌(E. coli O157:H7)和非目的菌(金黃色葡萄球菌 2 60 0 3、鼠傷寒沙門氏菌13311)，經過前增菌后，用制備的膠體金試紙條檢測，以測定該方法對于食品樣品的實用性。

目的菌和非目的菌按1.3節方法培養后，測量其OD600，用生理鹽水將全部菌稀釋至102～103CFU/mL，并用平板準確計數各稀釋液的濃度，目的菌稀釋液記為a液，將非目的菌各取0.5mL混勻記為b液。其他試劑按表3進行，將各組37℃搖床培養10h。取各組增菌液用制備的膠體金試紙條檢測，并將增菌液涂布與山梨醇麥康凱瓊脂培養基上(E. coli O157:H7為無色菌落，其他菌為粉紅色或紅色菌落)，以驗證試紙條檢測的準確性。

2 結果與分析

2.1 制備的膠體金分析

制備的膠體金紫外-可見光譜圖見圖1，其在535nm左右有強吸收峰。用透射電子顯微鏡觀察顆粒大小均一，約為40nm左右(圖2)。

圖1 膠體金紫外掃描圖Fig.1 UV-visible spectrum of colloidal gold

圖2 膠體金電鏡圖Fig.2 TEM image of colloidal gold particles

2.2 標記pH值的確定

圖3結果表明，pH7.5～8.5時，膠體金仍保持原來紅色，膠體金溶液穩定，其他pH值條件下的膠體金有不同程度的顏色變淺現象。本實驗選擇pH8.0作為標記pH值。

圖3 標記pH值的確定結果Fig.3 pH for antibody labeling

2.3 最佳抗體標記量的確定

圖4結果顯示，8～11號管膠體金保持紅色，因此14μg為穩定1mL膠體金的必須蛋白量，本實驗實際用量為16.8μg/mL(抗E. coli O157:H7單克隆抗體/膠體金)。

圖4 最佳抗體標記量的確定結果Fig.4 Results for the optimization of antibody label amount

2.4 封閉劑的確定

如圖5所示，加入液體LB和PBS時，1號、3號、4號T線出現不同程度顯色，而2號T線不顯色，加入E.coli O157:H7菌液時，1～4號T線顯色無明顯差異。因此本實驗按2號方法標記膠體金。

表3 選擇性增菌實驗方案Table 3 Protocol of selective enrichment experiments

圖5 封閉劑的確定結果Fig.5 Results for the optimization of blocking reagent

2.5 待檢樣品最佳pH值的確定

待檢樣品的pH值對膠體金試紙條檢測影響很大，當樣品pH值低至5.0或高至9.0時，膠體金殘留于結合墊中，導致試紙條無效(C線不顯色)。陰性樣品pH值在5.5、6.0、6.5、8.0、8.5時，試紙條T線呈現不同程度的顯色；而pH值在7.0～7.5時，T線不顯色，非特異性吸附消除，結果見圖6。因此檢測時應將待檢樣品pH值調至7.0～7.5，以避免假陽性結果。

圖6 樣品最佳pH值的確定結果Fig.6 Results for the optimization of pH

2.6 試紙條特異性分析

試紙條與其他24株細菌呈陰性反應，包括腸致病性大腸桿菌(EPEC) CMCC44496、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC) CMCC 44350、大腸桿菌CMCC 44102、大腸桿菌2DBE2001、阪崎腸桿菌CMCC 45401、阪崎腸桿菌CMCC 45402、福氏志賀氏菌301、福氏志賀氏菌2457、白色假絲酵母Z1、枯草芽孢桿菌168、枯草芽孢桿菌BD366、金黃色葡萄球菌CMCC 26001、金黃色葡萄球菌CMCC 26002、副溶血弧菌CGMCC 1.1997、副溶血弧菌CGMCC1.1616、單核細胞增生李斯特氏菌CMCC 54001、單核細胞增生李斯特氏菌CMCC 54007、長雙歧桿菌NCC 2705、嬰兒雙歧桿菌ZDY18、短雙歧桿菌C5、青春雙歧桿菌LiB、嗜熱鏈球菌G1、保加利亞乳桿菌F1、變形桿菌CMCC 49027，編號依次為1～24。與金黃色葡萄球菌CMCC26003(編號25)、沙門氏菌ATCC 13311(編號26)呈弱陽性反應，試紙條與pH7.2的PBS(編號27)和液體LB(編號28)呈陰性反應。結果見圖7。

圖7 試紙條特異性實驗結果Fig.7 Specificity of the developed strip

2.7 試紙條靈敏度分析

本研究制備的E.coli O157:H7膠體金試紙條的靈敏度為104CFU/mL，結果見表4。

表4 試紙條靈敏度實驗結果Table 4 Sensitivity of the developed strip

2.8 食品樣品檢測

圖8 食品樣品檢測結果Fig.8 Detection of Escherichia coli O157:H7 in food samples

通過平板計數，確定了加入樣品中的目的菌和非目的菌均為10～100CFU。通過增菌10h，牛肉組1和萵苣組1用試紙條檢測均為陽性，牛肉組2和萵苣組2試紙條檢測結果均為陰性，如圖8所示，山梨醇麥康凱瓊脂平板顯示牛肉組1和萵苣組1中幾乎全部為目的菌，與試紙條檢測結果相符，而牛肉組2和萵苣組2中只有少數粉紅色菌落，說明通過添加選擇性試劑抑制了非目的菌的生長，因此用試紙條檢測為陰性，從而彌補了試紙條本身特異性不足。

3 討 論

E.coli O157:H7感染已經成為一個世界性公共衛生問題。建立快速準確的檢測方法是預防該菌感染的重要手段。近年各種細菌的膠體金快速檢測試紙條層出不窮。唐景峰等[16]制備了布魯氏菌膠體金試紙條，靈敏度為3×103～5×103CFU/mL之間；辛志明等[17]制備了豚鼠氣單胞菌膠體金試紙條，檢測靈敏度為106CFU/mL。

蛋白質主要通過電荷吸引力、疏水作用力和共價鍵吸附在金表面，但離子強度、pH值及封閉劑等會破壞這3種力從而影響層析系統的性能，造成假陽性結果。本研究著重從消除這種非特異性吸附，對標記時pH值及封閉劑等進行優化，制備的試紙條與樣品稀釋液(pH7.2 PBS)及液體LB呈陰性反應。試紙條與鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311和金黃色葡萄球菌CMCC 26003有輕微的交叉反應，這可能是由于E. coli O157:H7與這兩種菌有較多的相似抗原。對制備的試紙條應用于實際樣品檢測有以下思路：在樣品前增菌過程中添加選擇性試劑選擇目的菌，以彌補試紙條特異性方面的不足；試紙條與前增菌培養基、稀釋液應配套使用；將待檢樣品pH值調至7.0～7.5。用本研究所得的試紙條檢測E.coli O157:H7快速、準確，具有很好的應用前景。

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Preparation of Colloidal Gold Strip for the Detection of Escherichia coli O157:H7

HUANG Ling-fang1，DUAN Xia1，CHEN Yuan2，LIU Wen-juan2，WEI Hua1，LAI Wei-hua1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Jiangxi Zodolabs Biological Engineering Co. Ltd., Nanchang 330029, China)

Anti-Escherichia coli O157:H7 monoclonal antibody was labeled with colloidal gold to prepare a strip for the detection of E. coli O157: H7. Anti-E. coli O157:H7 polyclonal antibody and donkey anti-mouse IgG were dispensed on the nitrocellulose membrane as the test line and control line, respectively. The optimal conjugation was performed using 16.8μg/mL antibody at the condition of pH 8.0 and blocked with PEG20000. However, the optimal pH range for the detection was 7.0－7.5. Cross-reaction test was conducted by 26 bacteria strains. Results showed no obvious cross-reaction were observed except for the slight cross-reaction from Salmonella typhimurium ATCC13311 and Staphylococcus aureus CMCC26003.Meanwhile, the sensitivity of the developed strip was up to 104CFU/mL. Moreover, this kind of developed strip was characteristics of simple operation, rapid detection, high sensitivity and specificity.

Escherichia coli O157:H7；colloidal gold；strip

TS207.4

A

1002-6630(2010)24-0355-05

2010-08-03

科技部中小企業創新基金項目(10C26223601934)；南昌市重大產業化項目(2009)

黃嶺芳(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品質量與安全。E-mail：hlf8406@163.com

賴衛華(1968—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：talktolaiwh@163.com