苦蕎和甜蕎二氫黃酮醇4-還原酶基因(dfr)的克隆及序列分析

祝 婷，李成磊，吳 琦﹡，蒙 華，陳 惠，邵繼榮

(四川農業大學生命科學與理學院，四川 雅安 625014)

苦蕎和甜蕎二氫黃酮醇4-還原酶基因(dfr)的克隆及序列分析

祝 婷，李成磊，吳 琦﹡，蒙 華，陳 惠，邵繼榮

(四川農業大學生命科學與理學院，四川 雅安 625014)

采用同源基因克隆的方法，以苦蕎和甜蕎葉片為材料，提取總RNA，經RT-PCR擴增獲得其二氫黃酮醇4-還原酶基因(dfr)cDNA序列，并通過T載體克隆后測序。序列分析表明，獲得了苦蕎和甜蕎dfr的全長cDNA編碼序列，其1026bp的全長開放閱讀框(ORF)均編碼341個氨基酸，并具典型的dfr結構特征和功能模塊。同源性分析顯示，苦蕎和甜蕎與其他植物的dfr基因核苷酸相似性為71%～98%；根據氨基酸序列構建系統進化樹表明，二者與豆科、桑科和薔薇科聚為一類。

苦蕎；甜蕎；二氫黃酮醇4-還原酶基因；克隆；序列分析

蕎麥是世界上一種重要的雜糧作物，它屬于蓼科(Polygonaceae)、蕎麥屬(FagopyrumMill)雙子葉禾谷類作物，主要栽培種有甜蕎(F. esculentumMoench也稱普通蕎麥)和苦蕎(F. tartaricum(L.) Gaertn又稱韃靼蕎麥)[1]。蕎麥的蛋白質含量很高，主要有谷蛋白、水溶性清蛋白和鹽溶性球蛋白等，其質量均優于大米、小麥、高粱和玉米，尤其是在苦蕎中，這3種蛋白占蛋白質總量的50%以上[2]。18種氨基酸中，蕎麥不僅有人體必需的8種氨基酸，更有谷類作物最缺少的賴氨酸[3]。加上它們均含有豐富的微量元素、維生素、食物纖維和多種礦物質以及蘆丁等生物類黃酮，可起到降低血液膽固醇、治療高血壓、控制糖尿病和微血管脆弱引起的出血病、防治便秘、延緩衰老等作用[4-5]，被譽為新型的綠色保健食品。目前在開發利用方面已有生物類黃酮散、生物類黃酮軟膏、生物類黃酮膠囊、生物類黃酮牙膏以及生物類黃酮口香糖等產品。隨著人們膳食結構的不斷改善，以蕎麥特別是苦蕎為原料的系列保健長壽食品將在人們生活中起到重要的作用。

二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)是花色素苷和原花色素生化合成途徑中的關鍵酶。1985年，O’Reilly等[6]采用轉座子標簽法首次從玉米和金魚草中分離了dfr基因。隨后，Beld等[7]以金魚草DFR基因為探針獲得了矮牽牛dfr基因。至今人們從多種植物如擬南芥、西紅柿、玫瑰、葡萄、水稻、百合等分離出了d fr基因。原花色素(o l i g o m e ri c proanthocyanidins，OPCs)為多羥基酚類化合物，衍生于黃烷類化合物，屬生物類黃酮，具有獨特的化學和藥理活性。本研究以苦蕎和甜蕎為材料，采用RT-PCR技術克隆其dfr基因的cDNA序列，對了解蕎麥花色素苷和原花色素生化合成途徑及蕎麥主要活性成分代謝的分子機制和在藥用次生代謝產物代謝過程中的作用有重要的意義，以期為發展花色基因工程和開發新型藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎和甜蕎種子購于四川阿壩農戶，種植于四川農業大學生物系實驗基地。經邵繼榮教授鑒定，二者分別是圓粒苦蕎和太平甜蕎。

R N Aout試劑盒 天澤基因工程有限公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA合成試劑盒 Fermentas公司；2×TaqPCR Master Mix 北京TIANGEN生物公司；無菌去離子水 實驗室自制；Gel Extraction Kit Omega公司；pMD19-T simple Vector 寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 儀器與設備

Thermo MicroLite RF 220/240高速冷凍離心機 美國熱電公司；MyCyclerTMThermal Cycler PCR儀、S.N.76S凝膠成像系統 美國BIO-RAD公司；DYY-Ⅲ-68型穩壓穩流電泳儀 北京市六一儀器廠；DNP-9272型電熱恒溫培養箱 上海精宏試驗設備有限公司。

1.3 總RNA提取及dfr基因cDNA的克隆

采用植物RNAout試劑盒提取蕎麥葉片的總RNA，電泳檢測。采用RevertAidTMFirst Strand cDNA合成試劑盒進行RT-PCR合成cDNA，反轉錄反應體系總體積為20μL，含總RNA 4μL、Oligo-dTPrimer(0.5μg/μL) 1μL、DEPC H2O 7μL、5×reaction buffer 4μL、RiboLockTMRiobonuclease Inhibitor 1 μ L和10mmol/L dNTP mix 2μL，最后加入1μL Revert AidTM M-MuLV Reverse Transcriptase。反應條件：42℃ 60min將mRNA反轉錄為cDNA第一鏈，70℃ 10min熱滅活反轉錄酶，將合成產物保存于－80℃冰箱備用。

以合成的cDNA為模板進行dfr基因cDNA全長克隆。參照NCBI登錄的金蕎麥(Fagopyrum cymosum)dfr基因(EF522145)全長的5'端和3'端UTR序列設計一對引物，上游引物5'-CTTTTCTCACCAAAACGACG-3'，下游引物5'-TTCTCACAAAAGTAAAACTAATCAA-3', 由上海英駿生物公司合成。PCR反應體系總體積為25μL，含2×TaqPCR Master Mix 12.5μL，10mmol/L 引物各1μL，DNA模板1μL和無菌去離子水9.5μL。PCR反應條件：94℃預變性5min，94℃變性50s、55℃退火50s、72℃延伸90s、35個循環，72℃延伸10min。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，采用Gel Extraction Kit回收后，與pMD19-T simple Vector連接，轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆，穿刺管培養后，送北京諾賽基因公司測序。

1.4dfr基因的序列分析

將測序結果拼接后，在GenBank進行生物信息學分析。應用DNAMAN軟件對推導的氨基酸序列進行多序列比對，并構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 蕎麥總RNA的提取

提取的總RNA的電泳檢測結果見圖1。圖1中各泳道可清晰觀察到28S RNA、18S RNA和mRNA 3條區帶，且28S RNA和18S RNA兩者比例符合2:1的特點，表明提取的RNA較為完整，質量較高，可用于RTPCR。

圖1 蕎麥總RNA的電泳檢測Fig.1 Electrophoresis patterns of total RNA from tartary buckwheat and common buckwheat

2.2dfr基因的擴增及序列分析

圖2 dfr基因全長cDNA PCR擴增產物Fig.2 Full length PCR amplification products of dfr genes from tartary buckwheat and common buckwheat

將苦蕎和甜蕎的總RNA反轉錄成cDNA后，再經PCR擴增，均得到約1200bp的特異性條帶，結果見圖2。序列分析表明，苦蕎d f r基因的c D N A長度為1185bp，包含1026bp的完整開放閱讀框(ORF)，在NCBI Genebank的登錄號為GU169468, 將該序列命名為Ftdfr；甜蕎dfr基因的cDNA長度為1192bp，包含1026bp的完整開放閱讀框(ORF)，在NCBI Genebank的登錄號為GU169469，將該序列命名為Fedfr。Ftdfr和Fedfr均編碼一個含341氨基酸殘基的蛋白質(圖3)。經在線蛋白質分析服務器(http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam)分析表明，Ftdfr相對分子質量為38.53，推測的等電點(pI)為5.78；Fedfr相對分子質量為38.55，推測的等電點(pI)為5.60。此外，在Ftdfr和Fedfr起始密碼子ATG附近存在CCATGG序列，與參與真核生物翻譯起始的Kozak保守序列(A/GXXATGG)一致。

圖3 Ftdfr與Fedfr的cDNA序列及推導的氨基酸序列比較Fig.3 Comparison of cDNA sequences and deduced amino acid sequences between dfr genes from tartary buckwheat and common buckwheat

2.3 植物dfr的序列比對與進化分析

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站對Ftdfr進行Blastn比對分析，結果表明該基因的核苷酸序列與其他植物的dfr基因的相似性較高，與金蕎麥(Fagopyrum cymosum)、甜蕎(Fagopyrum esculentum)、水蓼(Persicaria hydropiper)、單籽山楂(Crataegus monogyna)、蘋果(Malus x domestica)、西洋梨(Pyrus communis)、美洲商路(Phytolacca americana)、瞿麥(Gypsophila elegans)、菠菜(Spinacia oleracea)和苜蓿(Medicago truncatula)等的dfr基因相似性均在71%～98%之間，其中與金蕎麥相似性最高，為98%(表1)。

表1 Ftdfr與其他植物dfr基因的同源性比較Table 1 Homologous comparison of nucleotide sequences among dfr genes from tartary buckwheat and other plant species

以苦蕎ORF序列推導的蛋白質序列進行BLASTp分析結果表明，苦蕎dfr基因編碼蛋白與其他植物的二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)有高度同源性，其中與金蕎麥dfr同源性最高為98%。利用DNAMAN軟件將Ftdfr與Fedfr推導的氨基酸序列與同源蛋白進行多序列比對(圖4)，發現在DFR蛋白質序列中存在一個NADP(H)結合保守區域VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY，還存在一個底物特異性結合保守區域TVNVEEKQKPVYDETCWSDV DFCRRV。比對結果表明二者與金蕎麥、蘋果、美洲商路、石竹、擬南芥等在DFR蛋白氨基酸序列系統進化上有高度保守性。

圖4 FtDFR和FeDFR與其他植物DFR的氨基酸序列比對Fig.4 Amino acid sequence alignment among dfrgenes from tartary buckwheat and common buckwheat and other plant species

圖5 不同植物DFR氨基酸序列的進化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on amino acid sequence encoded by dfr gene in different plant species

基于Ftdfr和Fedfr氨基酸序列構建系統進化樹，結果見圖5。結果表明這些植物共聚為3大類，蓼科的苦蕎、甜蕎和金蕎，豆科的苜蓿和黃豆，桑科的啤酒花，薔薇科的蘋果、單籽山楂和西洋梨聚為一類，商路科的美洲商路，藜科的菠菜，石竹科的瞿麥和石竹聚為一類，十字花科的擬南芥和玄參科的金魚草為另一類。其中，苦蕎與金蕎麥的同源關系最近，其次是甜蕎。

3 討 論

3.1 二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)是花色素苷生化合成途徑中的關鍵酶，是一個重要的調控點。它催化二氫黃酮醇在C4位發生立體特異的還原反應[8]，繼而在花色素苷合成酶(anthocyanin synthase，ANS)和類黃酮3-O-糖基轉移酶(flavonoid 3-O-glucosyltransferase，3GT)的作用下合成各種花色素苷[9]。因此，DFR 是將二氫黃酮醇轉變為花色素苷反應的第一個酶，這一反應需要NADP (H)。在不同的物種中，DFR與NADP(H)的結合區域“VTGAAGFIGSWLIMRLLERGY”是高度保守的[10]。不同物種的DFR對底物選擇性和表達水平的不同促使不同花色素的合成。關于底物選擇特異性的分子機制，早期的研究者提出了一個26個氨基酸的底物特異選擇的結構域[7]，DFR對不同底物的結合是由其分子中底物結合區的氨基酸序列所決定，這個序列在不同物種中也是高度保守的[11]。該結合區132 位與 141 位的氨基酸可直接影響酶的底物特異性，大多數物種在132 位含有D(天冬氨酸)或N(天冬酞胺)，分別被稱為Asp型DFR和Asn型DFR；還有一類DFR的第132位氨基酸殘基既不是天冬氨酸也不是天冬酰胺，因此被稱為非Asn/Asp型DFR[12]。在植物中Asn型DFR分布廣泛，單子葉植物都是Asn型DFR，而Asp型DFR只分布在部分雙子葉植物中。此外，只有少數植物含有非Asn/Asp型DFR[13]，并且在進化上分布較遠，由此推測Asp型和非Asn/Asp型DFR有可能是由Asn型DFR進化而來。本研究中苦蕎和甜蕎均屬雙子葉植物，而且DFR氨基酸序列的132位為N，則推測其為Asn型DFR，且具有底物選擇特異性。

3.2 金蕎與甜蕎和苦蕎之間的親緣關系是蕎麥屬種間親緣關系爭論的焦點。Steward[14]、Suvorova等[15]和王莉花等[16]認為金蕎與甜蕎之間的親緣關系比與苦蕎的親緣關系近。Kishima等[17]、Sharma等[18]和趙佐成等[19]認為金蕎與苦蕎的親緣關系比與甜蕎的親緣關系近。這可能是由于各學者所采用的材料不同或者是野生種不同種群間遺傳差異等造成。本研究通過比較不同植物DFR氨基酸序列構建的系統進化樹表明金蕎和苦蕎的親緣關系與金蕎和甜蕎的親緣關系相比較更近。可見，分析同源蛋白的結構對研究種屬和種間差異也具有重要意義。

3.3dfr基因已在多種植物中得到分離，其分子特征和調控機制也得到了深入研究，發現它通常是單基因和小基因家族[8]。已報道的dfr基因為單基因的植物有擬南芥[20]和金魚草[21]等。植物基因啟動子是重要的順式作用元件，位于結構基因5′端上游，指導酶與模板的正確結合，活化RNA聚合酶，決定轉錄起始部位和轉錄效率，影響基因的表達。本研究在首次克隆苦蕎和甜蕎中dfr基因的全長cDNA編碼序列的基礎上，擬進一步對其啟動子和基因表達調控等進行深入研究。

由于蕎麥含有獨特生物活性成分，具有較高的營養價值和藥用價值，蕎麥制品正日益受到人們的青睞[22]。我國蕎麥資源豐富，利用生物技術擴展對dfr的研究對于黃酮代謝途徑工程的研究和保健食品等的開發具有重要作用。

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Cloning and Sequence Analysis of Dihydroflavonol 4-Reductase Genes from Tartary Buckwheat and Common Buckwheat

ZHU Ting，LI Cheng-lei，WU Qi*，MENG Hua，CHEN Hui，SHAO Ji-rong
(College of Life Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The cDNA sequence of dihydroflavonol 4-reductase (DFR) gene was amplified from total RNA from the leaves of tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum) and common buckwheat (Fagopyrum esculentum) by RT-PCR using homology-based cloning strategy. The amplified fragments were then cloned into T-vector. Sequence analysis indicated that both cDNAs had open reading frames of 1026 bp in full length, which encoded a polypeptide composed of 341 amino acids with typical structure characteristics and functional module of DFR enzyme, respectively. The nucleotide similarity ofdfrgene amongFagopyrum tataricum,Fagopyrum esculentumand other plants ranged from 71% to 98%. In addition, the phylogenetic analysis based on amino acid sequence enconded bydfrgene indicated that both buckwheat varieties,Leguminosae,Moraceae andRosaceaewere classified into one class.

Fagopyrum tataricumGaertn；Fagopyrum esculentumMoench；dihydroflavonol 4-reductase (dfr) gene；cloning；sequence analysis

Q943.2

A

1002-6630(2010)13-0219-05

2009-12-29

四川省科技廳科技攻關項目(04NG001-015；2006Z08-012)

祝婷(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為基因工程。E-mail：wuyutingpeng@126.com

﹡通信作者：吳琦(1973—)，男，副教授，博士，研究方向為酶工程。E-mail：wuqiwq@yahoo.cn